[发明专利]一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法

权利要求书

1.一种双荧光基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.一种哺乳动物表达载体，含有权利要求1所述的双荧光基因。

3.一种用于促通读药物筛选的有限细胞株的建立方法，包括如下步骤：

1）利用基因重组技术将DsRed和EGFP基因克隆到pEGFP-N1哺乳动物表达载体上，构建成pDsRed-EGFP，重组质粒经酶切鉴定；

2）利用PCR快速定点突变方法，将DsRed基因的终止密码子tag突变至tac，并且调整DsRed和EGFP基因至一个阅读框，构建成双荧光哺乳动物表达载体pDsRed-EGFPmtag-；

3）利用PCR定点突变的方法，将绿色荧光蛋白EGFP的445氨基酸位置突变为含有一个提前终止密码子，得到双荧光哺乳动物表达载体的突变体pDsRed-EGFPmtag-Y445X；

4）在培养基DMEM中添加10%胎牛血清，培养非洲绿猴肾细胞Cos-7，然后加入胰酶消化细胞，按2×10⁵cell/mL密度种于6孔板；

5）利用脂质体Lipofectamine^TM2000将质粒pDsRed-EGFPmtag-和pDsRed-EGFPmtag-Y445X分别转染Cos-7细胞，转染8小时后，更换新鲜培养基得到有限细胞株。