[发明专利]一种利用固定化拟无枝酸菌转化阿魏酸生产香草醛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）zhp06，即CCTCC NO：M2011265的固定化，及其转化阿魏酸制备香草醛的生物转化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）又名香兰素，香茅醛，相对分子质量152.15，白色至微黄色针状或粉末状结晶，是香荚兰的主要成分，主要应用于食品、饮料、香料、医药、皮革、电镀和药物等行业中。

香草醛的生产方法主要是化学合成法，其主要来源是由石油化工产品愈创木酚、木质素等的化学合成，这种方法合成的香草醛不仅香型单一，而且合成过程中环境污染较严重，人们对安全性的担忧日益增加；香草醛的另一种生产方法是植物提取法，每年从香草兰豆荚中提取的天然香草醛只有40t，这远远不能够满足人们的的需求（每年16000t）；因此，微生物香草醛的研究应运而生。微生物香草醛生产过程是环境友好型，已经得到欧洲立法的承认(EEC No1334/2008)。

在微生物合成香草醛中前体物质有很多，如香草醇、香草胺、松柏醇、藜芦醇、阿魏酸、香草酸、丁香酚和异丁香酚等，其中阿魏酸为前体合成香草醛最受关注，并安全性受到认可。法国的Lesage-Meessen等人最先采用两步法，即利用黑曲霉先将阿魏酸转化为香草酸，再由朱红密孔菌进一步转化成香草醛，其香草醛的浓度为0.237g/L；周庆礼等人筛选的链霉菌一步转化阿魏酸生产香草醛，流加两次底物，产量为7.12g/L；许平等人利用链霉菌通过发酵过程添加树脂，使转化的产量最高达到19.2g/L，摩尔转化率54.45%；意大利的Diana DiGioia等利用假单胞菌转化阿魏酸到香草醛最高产量为1.27g/L，意大利同一研究团队还研究了大肠杆菌工程菌生产香草醛，产量达到2.52g/L。但是这些转化过程周期长，生产效率低；对原料阿魏酸的转化率不高（摩尔转化率20%-70%），生产成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用固定化拟无枝酸菌转化阿魏酸生产香草醛的方法，在筛选到一株可转化阿魏酸为香草醛的拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）zhp06即CCTCC NO：M2011265（中国专利CN102321563A已公开）的基础上，提供一种拟无枝酸菌固定化及其固定化细胞转化阿魏酸制备香草醛的方法。通过固定化细胞重复利用，提高转化效率，降低培养微生物的成本，同时使得产物香草醛容易提取。

本发明的技术方案：一种利用固定化拟无枝酸菌转化阿魏酸制备香草醛的方法，其步骤包括：

（1）种子培养：将实验室保藏的拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）zhp06，即CCTCC NO：M2011265，斜面菌种接种到种子培养基中，放置到28-45℃，100-300r/min的恒温摇床中培养10~36h。

（2）菌体准备：将步骤（1）所得种子接种到菌体扩大培养基中，放置到28-45℃，100-300r/min的恒温摇床中培养10~36h。

所述种子培养和种子扩大培养使用的液体培养基配方为：葡萄糖1～10g，酵母膏5～20g，Na₂HPO₄·12H₂O1～10g，KH₂PO₄0.1～2g，NaCl0.05～0.5g，MgSO₄·7H₂O0.05～0.5g，CaCl₂·2H₂O0.05～0.1g；用自来水定容到1L，调pH至7.2～7.4，121℃灭菌20min；接种量为1%-10%。

（3）固定化细胞制备：将用清水洗净的木屑或甘蔗渣等纤维质材料粉碎成粒径为20目到120目，用清水清洗净后灭菌，按60-300g/L用量加入到培养好菌体的步骤（2）所得培养液中，常温搅拌吸附1-24h，过滤得到固定化细胞。

（4）转化阿魏酸为香草醛：以步骤（3）中得到的固定化细胞为催化剂，与底物阿魏酸溶液混合，在35-40℃下进行转化反应。

底物阿魏酸溶液组成：K₂HPO₃3～6g/L，KH₂PO₃0.1～1g/L，底物（阿魏酸）5-50g/L，初始pH为7.0-9.0，在摇瓶或发酵罐中进行反应。

摇瓶转化：装液量30-100mL/250-500mL三角瓶，转速100-300r/min，转化10-48h。