[发明专利]一种重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物工程领域，具体涉及重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及重组尿酸氧化酶蛋白的层析分离纯化。

背景技术

尿酸氧化酶( urate oxygen oxidoreductase,EC 1. 7. 3. 3, 简称UC) 是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶, 它能够催化尿酸氧化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。许多物种中均发现有尿酸氧化酶存在, 但在高等哺乳动物( 猿和人类) 体内却缺乏有生物活性的尿酸氧化酶, 因而尿酸就作为嘌呤代谢的最终产物。

研究发现,尿酸水平与痛风、高血压、血管病、糖尿病、肾脏病及许多临床综合症相关。尿酸氧化酶作为检测血液中尿酸浓度的关键试剂, 在临床检测血液中的尿酸含量中起到重要的作用, 检测得到数据的准确性很大程度上取决于尿酸氧化酶的稳定性和可靠性。此外, 在临床治疗中由于尿酸氧化酶可以快速地降低血液中尿酸含量, 因此其治疗作用也受到广泛关注。

国外有关报道中表明:可以通过使用尿酸氧化酶治疗痛风病以及由于高尿酸水平引发的其它并发症。近年来有许多报道利用尿酸氧化酶来治疗肿瘤溶解综合症( 简称TLS) 。肿瘤溶解综合症是一种危及生命的代谢病发症,它主要发生在恶性肿瘤的患者的化疗过程中, 包括淋巴瘤和白血病的患者。由于在化疗开始后或者高度繁殖的肿瘤所引发的核酸的快速降解，导致高尿酸症是TLS产生的主要症状。当尿酸盐的浓度超过肾脏的排泄能力的时候, 病人就会在肾小管中沉淀尿酸, 然后发展成急性肾衰竭，使病人遭受极大的病痛。传统的预防和治疗高尿酸症的方法是利用别嘌呤醇, 碱化尿酸水解尿酸, 但碱化会产生副作用, 例如加剧血液高磷酸盐症和低血钙症, 使病人的病症更加复杂化。Stanton C等人在1996-1997年对52个病人的研究证明:尿酸氧化酶是传统的别嘌呤醇的一种安全、有效的替代品,可快速控制血浆中尿酸的浓度,降低病人在化疗中出现肿瘤溶解的风险。Bertrand Coiffier等人在2001-2002年对100位患有恶性非霍奇金淋巴瘤的病人在化疗中使用了重组尿酸氧化酶, 用来检测尿酸氧化酶在第一轮化疗过程中对预防肿瘤溶解症的效果和其使用的安全性,实验证明尿酸氧化酶可以有效地控制血液中尿酸的含量,在预防和治疗患有恶性非霍奇金淋巴瘤肿瘤溶解综合症中起到了很好的作用。

2001年6月，法国Sanofi-Synthelabo公司开发的重组黄曲霉尿酸氧化酶首次在德国和英国上市，用于治疗和预防具有高危肿瘤溶解综合症的血液恶性肿瘤病人的急性高尿酸血症。

然而，国外采用酿酒酵母来表达生产重组黄曲霉尿酸氧化酶，相对于酵母的长发酵周期和复杂的工艺控制，其13%的表达水平并不理想，从而导致了最终产品的价格居高不下。而在大肠杆菌中，重组黄曲霉尿酸氧化酶的胞质表达效果不佳，如采用融合表达方式虽然可以解决表达量的问题，但是后续的蛋白酶切割条件不容易控制，同时也给生产应用引入了蛋白酶残留、非特异性切割等困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及纯化方法，克服现有技术中使用酿酒酵母生产重组黄曲霉尿酸氧化酶时，其发酵周期较长并且工艺控制复杂，其13%的表达水平并不理想，从而导致了最终产品的价格居高不下。大肠杆菌表达黄曲霉尿酸氧化酶时，其胞质表达形式的表达效果不佳；采用融合表达方式虽然可以解决表达量的问题，但是后续的蛋白酶切割条件不容易控制，同时也给生产应用引入了蛋白酶残留、非特异性切割等困难。对实际生产应用形成了制约的缺点。

本发明的技术路线是：选择使用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控下游基因转录，同时，优化改造了大肠杆菌LamB信号肽（LamB signal peptide）的编码序列（SEQ2），突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构,使其更利于引导黄曲霉尿酸氧化酶的（SEQ3.1）的分泌表达，经实验证明，优化过后的信号肽具有更高的引导蛋白分泌的效率。以上述启动子、信号肽组合作为表达调控元件，能够使重组尿酸氧化酶在大肠杆菌中实现高效的分泌表达，为最终开发低成本尿酸氧化酶制品奠定了基础。

本发明的技术方案是：

1、提供一种表达重组尿酸氧化酶的大肠杆菌操纵子，其结构包括：大肠杆菌碱性磷酸酶启动子（phoA promoter，SEQ1）、大肠杆菌LamB信号肽（LamB signal peptide）的编码序列（SEQ2）、人工合成的重组尿酸氧化酶的编码序列（SEQ3）。

2、提供将上述操纵子克隆至携大肠杆菌质粒载体pBR322中获得的表达质粒pPLS-UOX。