[发明专利]一种狂犬病毒疫苗增效蛋白及编码该蛋白的基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种狂犬病毒疫苗增效蛋白及编码该蛋白的基因和应用。

背景技术

狂犬病是当前威胁人类健康的一种比较严重的急性传染病，人类患者一旦被病畜咬伤而发病，死亡率高达95%以上。当前我国狂犬病形势也相当严峻，发病率居世界第二位，仅次于印度。通过注射狂犬病毒疫苗预防狂犬病的感染是当前控制狂犬病发病的重要途径。但是目前狂犬病毒疫苗的免疫效果在人群中存在较大差异，且注射后体内狂犬病毒抗体的滴度上升到具有保护效力的滴度所需要的时间较长，不足以在病毒潜伏期内产生足够的抗体以抵抗狂犬病毒的感染和发病。因此寻找能够有效增强狂犬病毒疫苗免疫源性的分子作为佐剂是解决该问题的一个重要途径。

采用基因工程原理，应用原核（如大肠杆菌）表达系统或真核（如酵母、哺乳动物细胞等）表达系统克隆表达某种蛋白是获取大量该蛋白的最为有效的方法。将其与狂犬病毒疫苗一同免疫动物，再用ELISA方法测定动物体内狂犬病毒特异性抗原的抗体效价，可以很方便地观察到该蛋白是否能够增强狂犬病毒疫苗的免疫效果，从而推断该蛋白在狂犬病毒疫苗领域是否具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种狂犬病毒疫苗的增效蛋白及编码该蛋白的基因，并提供表达该蛋白的方法和应用。

本发明提供的狂犬病毒疫苗的增效蛋白（记为SBP），其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1所示，具有如下功能特征：① 可与狂犬病毒疫苗亲和，测得亲和常数可达1.16×10⁷L/mol；②与狂犬病毒疫苗注射动物或人体，可以缩短达到保护效力的抗体滴度的时间，提高免疫应答效率和强度。

本发明还提供编码所述狂犬病毒疫苗的增效蛋白的基因，其氨基酸序列为SEQ.ID.N0.2所示。

通过基因工程改造，本发明还获得了一系列同源性达80%以上的具有对狂犬病毒疫苗有增效功能的序列。具体包含以下序列：

1、通过体外扩增拼接或DNA人工合成得到若干具有和SBP同样免疫增效功能的基因序列，基因序列号为SEQ.ID.NO.3-- SEQ.ID.NO.5，经过修饰的蛋白序列：SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7。

2、通过定点突变、基因重组等手段获得了几种具有更强亲和力免疫增效功能的蛋白序列：SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9。

3、通过各种方法获得的与上述基因或蛋白质序列（SEQ.ID.NO.1-- SEQ.ID.NO.9）同源性达80%以上并具有与狂犬病毒疫苗高度亲和性及对狂犬病毒疫苗具有显著增效功能的序列，上述序列统称为SBPs。 

将上述DNA序列/片段直接克隆到pBV220或其它原核表达载体，经诱导表达获得重组蛋白；也可将上述表达片段克隆到真核表达载体如pEGFP-N1、pICZα(a,b,c)等在哺乳细胞和酵母中表达。运用Ni-NTA agarose、交联有SPA、ConA、mAb等的亲和柱进行纯化，最终得到纯化的目的蛋白。

本发明的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1的蛋白可作为狂犬病毒疫苗佐剂。该蛋白与狂犬病毒疫苗具有高亲和性，与狂犬病毒（抗原）疫苗联用可显著加速狂犬病毒（抗原）抗体产生的时间，提高疫苗的免疫效果，提高动物体内保护性抗体滴度，可用于在动物受病毒侵染后应急防治保护。

本发明的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2的蛋白可作为狂犬病毒疫苗佐剂。通过重组表达与SBP具有80%以上同源性的蛋白，包括和其他抗原成分（如各种蛋白多肽）的融合、聚合、混合等各种联合方式一起使用，产生协同增效作用的有效形式。

该蛋白对狂犬病毒疫苗亲和性实验的结果:用不同稀释度的疫苗液体(1:5、1:10、1:20、1:40、1:80)包被96孔酶标板，孵育后加入SBP作为一抗，抗人IgG为二抗进行ELISA反应，测得的OD值与未加入SBP的结果进行对照，观察SBP与狂犬病毒疫苗的亲和性。结果证明SBP与狂犬病毒具有极强的亲和力，亲和常数Ka>10⁷L/mol。

该蛋白对狂犬病毒疫苗免疫效果的影响:将实验动物分为试验组和对照组。以小鼠为例，按常规方法用狂犬病毒疫苗免疫小鼠，皮下注射。在免疫后的第12、20、28、42天从小鼠尾静脉取血，分离血清。用ELISA方法测定小鼠体内抗狂犬病毒抗体的滴度。SPSS软件分析试验组和对照组的差异。结果发现该蛋白可以明显增强小鼠体内抗体的滴度，即该蛋白可以增强狂犬病毒疫苗的免疫效果。