[发明专利]靶向血管紧张素原的RNA干扰片段、其表达载体、混合克隆细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及RNA干扰及应用领域，更具体地说是涉及靶向血管紧张素原的RNA干扰片段、其表达载体及其应用。 

背景技术

肾素－血管紧张素系统（Renin-Angiotensin System,RAS）是生理功能复杂的内分泌系统，已确定与人类心脑血管疾病、糖尿病、肝脏、肾脏疾病等有密切的关系，其源头即为血管紧张素原（angiotensinogen,AGT）。近年的研究发现机体脂肪组织中存在RAS的所有成分，提示RAS与脂肪细胞的分化和增殖有密切关系，而脂肪细胞的异常分化与增殖又是导致肥胖的直接原因。 

RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）是近年来迅速发展起来的一项高效基因研究技术，在哺乳动物细胞中利用该技术成功阻断基因的表达，可实现细胞水平的基因敲除。通过干扰脂肪细胞中AGT基因的表达以抑制RAS发挥作用，达到抑制前脂肪细胞分化的效果。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰序列，能干扰降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。 

本发明要解决的另一技术问题在于：提供一种针对血管紧张素原的RNAi片段构建的表达载体，能降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。 

本发明要解决的又一技术问题在于：提供一种混合克隆细胞株，降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成。 

本发明要解决的再一技术问题在于：提供靶向血管紧张素原的RNA干扰片段在抑制肥胖形成中的应用。 

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段，其序列为SEQ ID NO.1。 

进一步地，所述血管紧张素原是针对鼠前脂肪细胞内的血管紧张素原。 

所述鼠血管紧张素原AGT基因的cDNA序列NM007428，其序列表为SEQ ID NO.2。 

本发明还提供一种靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，该表达载体含有所述的RNA干扰片段。 

该表达载体具有图1a所示的结构。 

所述的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段表达载体，插入载体的siR结构为表1所示siR-AGT对应的结构。 

本发明进一步提供一种混合克隆细胞株，能降低细胞中血管紧张素原AGT的表达，进而降低脂肪细胞分化程度而抑制脂肪的形成，是由所述靶向血管紧张素原的RNA干扰片段构建表达载体质粒并转染前脂肪细胞株而建立的。 

所述的混合克隆细胞株具体由下述步骤制得的： 

步骤1：RNAi干扰片段siR的设计； 

步骤2：以设计好的RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT-U6.1/NeoRNAi而构建及合成表达载体质粒PsiR； 

步骤3：以表达载体质粒PsiR转染鼠前脂肪细胞3T3-L1，并建立混合克隆株。 

进一步地，所述步骤2具体为：RNAi干扰片段siR插入载体psiRNAT-U6.1/NeoRNAi构建并合成表1的siR-AGT寡聚核苷酸单链后，再经退火成双链RNAi片段，PsiRNAT-U6.1/Neo载体经BamH I和Hind III双酶切成线性载体，最后经T4连接酶与双链RNAi片段连接构建成PsiR表达载体质粒，表达载体结构为图1a。 

本发明还提供靶向血管紧张素原的RNA干扰片段用于抑制肥胖的应用。 

本发明的有益效果如下： 

由于本发明设计的靶向血管紧张素原的RNA干扰片段siR经过克隆入载体，转入前脂肪细胞中，血管紧张素原在转录后表达水平明显下调，同时前脂肪细胞向成熟细胞的分化也明显受到抑制，因此本发明所涉及的干扰序列可以用于抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，具有降低脂肪细胞含量，抑制肥胖形成的用途。 

附图说明

图1是本发明实施例构建的重组载体质粒psiRNAT-U6.1/Neo的图谱；其 中图1（a）为PsiR重组载体结构，代表插入siR干扰片段后的质粒图谱；图1（b）为PsiR0重组载体结构图，代表插入siR0干扰片段后的质粒图谱。 

图2是本发明实施例的RNAi表达载体测序结果图，其中图（a）为PsiR测序结果图，图（b）为PsiR0测序结果图；框内标示分别为siR和siR0的序列，1代表碱基G、2代表碱基A、3代表T、4代表C。