[发明专利]一种单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种单光子比率型和双光子光开关型荧光探针及其应用，尤其涉及一种咔唑吡啶类化合物的单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用。

背景技术

酸性细胞器如溶酶体是真核细胞中具有重要生理功能的细胞器之一，尤其是在细胞内消化，细胞凋亡和自体吞噬等生理活动中起着关键作用。同时研究发现，酸性细胞器内pH值异常和癌症关系密切。因此，实现细胞内酸性细胞器的荧光成像，并给出酸性细胞器内的pH分布的信息，有着重要的生命科学与医学价值。

一般来说，观测细胞内分子荧光成像的仪器有激光扫描共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜，其中双光子荧光显微镜在成像活细胞方面的优势较为明显。但目前适合这两种显微镜使用的、在活细胞内高选择性标记在酸性细胞器内的荧光探针十分缺乏。同时，随着激光扫描共聚焦显微镜和双光子显微镜技术的不断升级和完善，各种生物荧光探针的研究与开发也在不断创新，并且，从分子水平上设计、开发对活性生物体系（如完整活细胞）中的生理、病理学标记物具有特异性、专一性识别能力的荧光探针分子，始终是生命科学研究中的重要课题。

尤其是近几年来，双光子荧光三维成像技术发展迅速，而专用的双光子荧光探针的开发却未及时跟上，特别是在细胞内高选择性标记酸性细胞器的双光子荧光探针国际上较少报道。这在很大程度上制约了利用双光子三维成像技术进行细胞内酸性细胞器的成像与观测。因而开发、研制具有实际应用价值单、双光子酸性细胞器荧光探针是当务之急。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用。

本发明所述单、双光子酸性细胞器荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是咔唑吡啶类化合物，其通式如（I）所示：

其中：上述R₁表示烷基或羟烷基，R₂表示乙酰基或氢原子。

上述荧光探针中：化合物通式（I）中所述R₁优选表示C_1-6的烷基。

上述荧光探针中：化合物通式（I）中所述R₁最优选表示乙基，所述R₂最优选表示乙酰基；即：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑。。

本发明所述单、双光子酸性细胞器荧光探针（咔唑吡啶类化合物）的制备方法概述如下：

为了增加分子在生理环境下的适应性，发明人首先在咔唑氮上引入乙基、丁基或羟乙基，然后利用F-C反应合成了相应乙酰基咔唑，然后将乙酰基咔唑溴化，最后利用Hack反应得到终产物——咔唑吡啶类化合物。

上述咔唑吡啶类化合物的制备反应式如下：

本发明所述荧光探针作为标记酸性细胞器的单光子或双光子荧光探针在显示活细胞中酸性细胞器分布中的应用。

其中，所述酸性细胞器优先指溶酶体或线粒体；所述活细胞优选为HeLa细胞或SiHa细胞。

试验结果证实，本发明所述单、双光子荧光探针（咔唑吡啶类化合物）能够在活细胞中高选择性标记酸性细胞器，在细胞核周区域呈现出明显的荧光显微图像，这为酸性细胞器相关的病理学研究提供了有意的帮助，同时也为开发简捷、直观的荧光检测试剂提供了技术支持。

本发明的的有益效果是：利用大量的实验筛选，本发明确立了一类新型的高选择性标记酸性细胞器荧光探针分子，即咔唑吡啶类化合物。与其功能相近的单光子酸性细胞器荧光探针比，本发明所述咔唑吡啶酮类化合物具有价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点。进一步的试验证实，本发明的咔唑吡啶类化合物具有高的光开关比和双光子荧光活性吸收截面大的特点。并且本发明所述的探针和已有的探针Hochest33342、MTR具有良好生物相容性，在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。也预示本发明所述咔唑吡啶类化合物作为单光子比率型和双光子光开关型酸性细胞器荧光探针应用前景广阔。

附图说明

图1：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性SiHa和Hela细胞进行染色在宽场荧光显微镜下得到的荧光显微照片。其中a图为用3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑染色得到的荧光显微照片；b图为明场照片；c图为左中两图的合并图即共定位图。