[发明专利]一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养的技术领域，具体涉及一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜及其制备方法和应用。

背景技术

细胞扩增是细胞治疗和组织工程发展的必要前提，近年来发展的多种规模化培养贴壁细胞的新措施，已经在工程细胞系等大规模培养中广泛应用，即通过模拟细胞在体内的生长微环境与增殖活动，控制其扩增与定向分化是培养细胞的基本出发点。目前多用具有良好生物相容性材料来模拟细胞外基质，促进细胞的体外扩增，主要包括透明质酸、胶原、壳聚糖、海藻酸盐、明胶等。近年来，Matrigel由于其独特的性能在细胞培养中受到越来越多的关注，Matrigel在EHS小鼠肿瘤中分离出，主要包含层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含有一些微量的生长因子、表皮生长因子、转化生长因子-β、纤维细胞生长因子等。适用于作为多种细胞的培养基底，构建多种组织。但是其价格昂贵，同时其操作不方便，使其在细胞扩增培养上的大规模应用受到了一定的限制。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜及其制备方法，以该方法制得的复合凝胶膜含有具有生物相容性的多糖以及Matrigel，可模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，能够促进多种细胞的增殖。

本发明通过下述技术方案加以实现：

本发明的一种用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜，其特征在于以多糖和Matrigel为原料，采用钙离子作为交联剂，通过留延法（也称“流延法”）制备。

在本发明中，优选的，所述的多糖为海藻酸盐、果胶、透明质酸、硫酸软骨素中一种或多种多糖的组合。

在本发明中，优选的，所述的多糖/Matrigel复合凝胶膜是通过以下方法制备得到：

(1)称取一定量多糖，将其溶于去离子水中，制备成质量百分比浓度为0.1%-3%多糖溶液，搅拌直至全部溶解，备用；

(2)配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌，备用；

(3)取一定体积的Matrigel溶液（自制或购自BD公司，货号：354234），在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9-15mg/ml的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；

(4)在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5ml，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液0.1-8ml，加入0.5-5ml步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，形成用于细胞培养的复合凝胶膜。

9mg/ml的蛋白浓度（胶浓度）是Matrigel在特定温度下（22-35℃）自己形成凝胶的最低浓度，本发明中形成凝胶通过两种方式：

（1）依靠多糖与交联剂（氯化钙）发生化学反应而形成，在复合膜中matrigel含量比较低时，主要通过与多糖交联形成凝胶，Matrigel可与多糖形成半互穿网络结构而形成复合凝胶；

（2）当Matrigel浓度达到9mg/ml或以上时则与多糖共同形成双网络凝胶。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的用于细胞培养的多糖/Matrigel复合凝胶膜的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)称取一定量多糖，将其溶于去离子水中，制备成质量百分比浓度为0.1%-3%多糖溶液，搅拌直至全部溶解，备用；

(2)配制0.1M的氯化钙溶液，过滤灭菌，备用；

(3)取一定体积的Matrigel溶液（自制或购自BD公司，货号：354234），在其中加入一定量的去离子水形成蛋白浓度为9-15mg/ml的Matrigel溶液，整个操作过程需在冰上操作；

(4)在超净工作台中量取步骤(1)制备的溶液5ml，在其中加入步骤(3)制备的Matrigel溶液0.1-8ml，加入0.5-5ml步骤(2)配制的氯化钙溶液，混合搅拌，然后将其倒入细胞培养器皿或细胞培养板中，以上过程需在冰上操作，然后将其置于37℃培养箱中孵育2-5min，形成用于细胞培养的复合凝胶膜。

在本发明中，优选的，所述的多糖为海藻酸盐、果胶、透明质酸、硫酸软骨素中一种或多种多糖的组合。

该方法过程简单且通过该方法制备的复合凝胶膜，能够促进多种细胞的增殖，同时该复合凝胶膜具有良好的力学性能，可适合细胞的长期培养，并且可以根据细胞类型选择不同的Matrigel含量来调控基底膜的组成，选择不同交联剂的用量来调节基底刚度以调控细胞的粘附和分化行为。