[发明专利]一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法和在细胞培养中的应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

细胞培养是生物学科学研究、细胞治疗以及组织工程发展的必要前提，细胞培养板（皿）是细胞培养的基本装置，目前用于细胞培养板主要由聚苯乙烯或聚乙烯加工而成，适合于多种细胞的粘附和生长。随着细胞生物学的发展，对细胞培养板的性能要求也越来越高，普通的细胞培养板对一些原代细胞及贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞扩增的效果不佳。为了改善这些细胞的粘附和增殖情况，近年来，人们通过物理的方法将聚赖氨酸、胶原等生物相容性良好的材料涂覆在细胞板表面以促进细胞的粘附和增殖。例如：聚赖氨酸包被的表面可以改善细胞的贴附性和加快增殖，适用于无血清或低血清培养或神经元细胞培养、神经胶质细胞培养及转染细胞系培养（如HEK-293、PC12、L929、3T3细胞系）。胶原蛋白包被细胞培养板可以大幅度降低蛋白质的吸附。在该培养板上进行播种后，只要静置即可获得细胞的贴壁和增殖。可以抑制细胞的培养面因此，细胞的聚集的成型率高，所培养的细胞形态均一。近年来，Matrigel也被广泛的应用于细胞分化、血管形成和肿瘤生长有关的研究，美国专利US20030017589中采用matrigel涂覆的培养板用于培养胚胎干细胞。但是这些方法均存在操作复杂以及涂覆不均一的缺点。本发明旨在公开一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法，采用化学交联将Matrigel均一地固定在细胞培养板表面，用以多种细胞特别是神经类细胞的培养。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于细胞培养的涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法，以该方法制得细胞培养板表面涂覆有生物相容性良好的Matrigel。

本发明是通过下述技术方案加以实现，一种用于细胞培养的涂覆有Matrigel的细胞培养板，其特征在于，细胞培养板表面Matrigel的密度0.01-2mg/cm²。

在本发明中，Matrigel是通过共价键的方式与聚苯乙烯细胞培养板表面连接，相比于物理涂覆具有更好的稳定性和均一性。

上述的用于细胞培养的涂覆有Matrigel的细胞培养板的制备方法及由该方法制备得的细胞培养板，其特征在于包括以下过程：

(1)将聚苯乙烯细胞培养板或培养皿在无水乙醇中浸泡40min，用去离子水冲洗，真空干燥，备用；

(2)量取50ml去离子水，将0.05-0.2g羟基琥珀酰亚胺（NHS）以及0.5g2-吗啉乙磺酸水合物（MES）加入其中，混合搅拌30min-1h，过滤灭菌，并保存在4℃中备用；

(3)称取一定量的碳化二亚胺（EDC）溶于去离子水中，形成质量浓度为1-5%的碳化二亚胺溶液，过滤灭菌备用；

(4)将清洗好的培养板放入等离子发生器中，抽真空至0-1Pa，通入氧气至10-200Pa，调整放电功率在5-300W之间，进行射频放电0.5-10min；

(5)在真空状态下将步骤(2)配制的混合液加入到步骤(4)获得的培养板中，液面要完全覆盖培养板底部，10min后将一定体积的蛋白浓度为9-15mg/ml Matrigel溶液加入其中，混合均匀孵育30min；最后在混合液中加入步骤(3)获得的碳化二亚胺溶液，混合均匀后孵育30min以上；

(6)弃去步骤(5)获得的培养板中的混合液体，并用无菌去离子水冲洗3遍，干燥，封装，即得。

进一步的，本发明还提出了所述的涂覆有Matrigel的细胞培养板在细胞培养中的应用。

其中，优选的，所述的细胞为原代细胞及少数贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞，如神经元、LNCaP、PC-12等。

本发明的有益效果：

本发明采用先进的等离子喷涂技术在细胞培养板表面形成羧基表面，然后采用化学铆钉技术将Matrigel通过共价键的形式连接到聚苯乙烯细胞培养板或培养皿表面，形成涂覆有Matrigel的细胞培养板或培养皿。由于该培养板的基材表面采用化学相结合的表面处理方式，其表面的Matrigel不会溶出。相该培养板比于通过物理包被的细胞培养板，该培养板的保存时间更长。该培养板（皿）适用于原代细胞及少数贴壁困难，易成团，易脱落，生长缓慢的细胞的培养，如神经元、LNCaP、PC-12等，可使细胞贴壁更加牢固，细胞伸展充分，获得更稳定生长状态。