[发明专利]一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法

权利要求书

1.一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，包括：

（1）以酿酒酵母BY4742α作为敲除对象，设计含有酿酒酵母基因组上TGL3和TGL4基因上下游同源序列的引物，利用PCR技术，以PRS400系列质粒为模板，扩增出含有筛选标记的DNA片段；通过酿酒酵母电转化技术，将该DNA片段转入酿酒酵母中，利用筛选型培养基筛选TGL3TGL4双缺陷型酵母；

（2）利用PCR技术扩增获取PAH1上下游序列，并通过在扩增引物上分别设计上游的promoter区中的HindIII、NOTI和下游的terminator区中的BamHI、NOTI四个酶切序列及相应的保护碱基，以三片段一次性连接的方式将PAH1上下游序列插入到表达质粒YEplac195中；通过NOTI及terminate区上的PstI酶切位点对构建好的YEplac195-promoter-terminator进行双酶切，创造出一个酵母难以通过自身连接修复的缺口Gap，通过酿酒酵母电转化技术，将含有该Gap的质粒转入酵母，使酵母以自身基因组作为修复Gap的模板，将PAH1基因复制到质粒中；通过筛选平板剔去没有成功复制PAH1或修复YEplac195的酵母，针对筛选出来的酵母以酵母质粒提取技术进行质粒提取，并借助大肠杆菌DH5α进行富集，得到PAH1高表达质粒YEplac195-PAH1；

（3）利用酿酒酵母高效转化方法将PAH1高表达质粒YEplac195-PAH1转入TGL3和TGL4缺陷型酵母中，得到TAG代谢障碍型肥胖酵母模型。

2.根据权利要求1所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中的TGL3或TGL4基因上下游同源序列的引物序列具体为：

HO8-F:5'-GGAGTACAGGTATATGTAATAAAAGTCTGagattgtactgagagtgcac-3'；

HO9-R:5'-TAGAGGATATATAAGCAAGCCCGTGTTTTctgtgcggtatttcacaccg-3'；

HO79-F：5'-cgggatccGGCTCATTGCACGTTTGCAG-3'；

HO104-R:5'-ATGTAGTGGCGTCTTGGTTC-3'；

其中敲除TGL4基因所用引物为HO8-F和HO9-R，敲除TGL3基因所用引物为HO79-F和HO104-R；

步骤（2）中利用PCR技术扩增获取PAH1上下游序列，其具体引物序列为

HO21-F:5'-cgggatcCGTTCGCAGTTCCTAACACTG-3'；

HO22-R:5'-ataagaatgcggccgCTATCTTCAGTAATTTCTTCC-3'；

HO23-F:5'-ataagaatgcggccgCGATCCATACTGCATATTAA-3'；

HO24-R:5'-acgccaagctTGGGCGTACAATAATTGCTT-3'；

其中PAH1上游DNA片段扩增所用引物为HO21-F和HO22-R，下游DNA片段扩增所用引物为HO23-F和HO24-R。

3.根据权利要求1所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中的PCR体系为ddH₂O14.2μL，10×PFU PCR Buffer2μL，HO8-F或HO79-F1μL，HO9-R或HO104-R1μL，10mM dNTP0.3μL，5u/μL PFU DNA Polymerase0.5μL，PRS405或PRS4001μL；PCR反应条件为变性温度为95℃，退火温度为55℃，72℃延伸时间为5分钟，循环次数为35；

步骤（2）中的PCR反应体系为ddH₂O14.2μL，10×PFU PCR Buffer2μL，HO21或HO231μL，HO22或HO241μL，10mM dNTP0.3μL，5u/μL PFU DNA Polymerase0.5μL，Genetic DNA1μL；PCR反应条件为变性温度为95℃，退火温度为55℃，72℃延伸时间为1分钟，循环次数为33。