[发明专利]一种白桦叶片基因组DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是一种高质量白桦叶片基因组DNA提取方法。

背景技术

高纯度基因组DNA是基因组测序、基因克隆、分子杂交、基因文库构建和分子标记等一系列分子生物学研究的前提。白桦叶片中酚类、多糖、萜类等次生物质含量较高，特别是生长在我国东北白桦，由于要适应东北地区较为严酷的地理及气候环境，体内各种次生物质种类更多、含量更高，会对DNA的提取造成更为严重的影响。因此，如何去除这些杂质以获得高质量的DNA是白桦叶片基因组DNA提取过程中面临的主要问题，也是对白桦进行分子生物学研究的前提条件。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种高质量白桦叶片基因组DNA提取方法。

本发明的技术方案如下：

①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300μL改良STE溶液，300μL改良CTAB溶液（改良STE溶液和改良CTAB溶液等体积）和20μLβ—巯基乙醇，混合后震荡3min；改良CTAB溶液配方：2.5﹪（W/V）CTAB，150mmol/LTris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mmol/L NaCl；改良SET溶液配方：150mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl；

②常温5000g离心5min,弃上清；向沉淀中加入加600μL改良CTAB溶液和20μLβ—巯基乙醇70℃水浴15min后16060g离心5min；

③取上清加入等体积氯仿充分混匀，16060g离心5min，重复此步骤1~2次；

④取上清加入等体积的无水乙醇:异丙醇混合液(体积比为2:1)，上下颠倒混合均匀后常温下静置3min，6080g离心3min；

⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2~3次，干燥后溶于50μL TE或去离子水中；

⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。

本发明的提取方法方法能提取出高质量白桦叶片基因组DNA，其核心技术包括以下几个内容：1、改良了CTAB与STE溶液；2、采用常温下等体积的改良CTAB溶液和STE溶液洗涤经充分研磨的材料2次；3、水浴裂解温度由65℃提高至70℃；4、在沉淀DNA时，采用无水乙醇:异丙醇(体积比为2:1)混合沉淀剂，低速离心，以降低杂质的沉淀。这种方法能分离出高质量的白桦叶片基因组DNA。

附图说明

图1为不同方法提取的白桦DNA电泳结果；1、2泳道：为CTAB法提取的DNA；3、4泳道：为SDS法提取的DNA；5、6泳道：方法Ⅲ提取的DNA电泳；7泳道：方法Ⅳ（STE洗涤1次）提取的DNA；8泳道：方法Ⅴ（CTAB洗涤1次）提取的DNA；

图2为方法Ⅳ提取的白桦DNA电泳结果；1.和2泳道为STE和CTAB洗涤混合液洗涤1次后提取的白桦基因组DNA；3.和4泳道STE和CTAB洗涤混合液洗涤1次后提取的白桦基因组DNA；5.和6泳道为STE和CTAB洗涤混合液洗涤2次后提取的白桦基因组DNA；

图3为方法Ⅳ提取的白桦DNA EcoR I与MseI酶切电泳结果；1.为白桦叶片基因组DNA；2.白桦叶片基因组DNA被EcoR I酶切后电泳结果；3.白桦叶片基因组DNA被MseI酶电泳切结果；4.标准DNA分子量；5～7泳道为重复；

图4为白桦不同个体叶片基因组DNA的RAPD扩增结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

材料：白桦叶片取自东北林业大学校园内已达开花结实的白桦，于8月未摘取的成熟叶片，叶片保存在-20℃冰箱。

试剂：

CTAB溶液：（2﹪（W/V）CTAB，100mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/LEDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）

STE溶液：（100mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），

改良CTAB溶液：（2.5﹪（W/V）CTAB，150mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）；

改良SET溶液：（150mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）；