[发明专利]一种甘蔗叶的定性鉴别HPLC指纹图谱检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘蔗叶的定性鉴别HPLC指纹图谱检测方法，属于中药的分析检测领域。 

背景技术

甘蔗叶是禾本科植物甘蔗Saccharum sinensis Roxb.的叶。甘蔗广泛种植于热带、亚热带地区，我国甘蔗种植蔗区主要分布在广西、广东、台湾、福建及云南等地。甘蔗叶含有氨基酸、多糖和黄酮类等物质，其嫩叶和蔗梢含过氧化物酶等物质，具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗肿瘤等药理作用。国内外对甘蔗叶的研究并不多见，仅提取工艺、药效学筛选等报道。 

中药成分极其复杂，临床用药强调整体性，测定少数几种有效成分或指标成分，不足以确保药材或制剂质量，应该建立全面反映所含成分的指纹图谱，将更加有效地体现中药成分的整体性和综合作用，从而更好地评价中药的质量。中药指纹图谱作为一种有效的质量控制模式，以其科学的理论依据获得国际上的一致认可。 

发明内容

本发明的解决方案是提供一种甘蔗叶的定性鉴别HPLC指纹图谱检测方法，此方法简单、稳定、可靠、重复性好，可作为甘蔗叶的鉴定方法。 

本发明一种甘蔗叶的定性鉴别HPLC指纹图谱的测定包括以下步骤： 

1供试品溶液的制备：称取样品2g按料液比1∶25加入70％乙醇回流提取2h，减压浓缩，将浓缩样品上大孔树脂柱，先用100ml水洗脱洗至无色，然后用100ml70％乙醇洗脱，将洗脱液浓缩，并甲醇定容至5ml容量瓶，离心，备用。 

2色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为固定相，甲醇-0.1％冰乙酸水溶液为流动相，按以下体积百分比条件进行梯度洗脱：0～5min，20％A，5～15min，20％～28％A，15～30min，28％～34％A，30～40min，34％A，40～45min，34％～42％A，45～70min，42％～50％A，70～95min，50％～65％A；柱温25℃，检测器为紫外吸收检测器，检测波长320nm，流速1.0ml·min^-1。 

3测定方法：精密吸取供试品溶液20μL，按设定的色谱条件进样，测定，即得。在此条件下获取的甘蔗叶对照指纹图谱见附图1。 

下面对本分析方法的建立作进一步的描述： 

1供试品溶液的制备方法考察 

1.1提取方法的考察 

根据试验要求比较了超声和回流两种提取方法，结果见附图2、3。从图中可以看出由不同提取方法提取后的甘蔗叶的色谱图的性状及色谱峰的数目基本一致，回流提取2h比超声提取30min提取更加完全(色谱峰强度大)，因此，选用回流提取法进行甘蔗叶中有效成分提取。 

1.2样品除杂方法的考察 

考虑到样品颜色较深，色素较多，因此考察了除杂方法。实验中比较了石油醚萃取和大孔树脂洗脱两种方法，见附图4、5。从图中可以看出石油醚除杂方法处理的甘蔗叶的色谱图基线飘动比较大，小的杂峰比较密集，经过大孔树脂洗脱的甘蔗叶的色谱图基线较为平稳，而且杂峰较少，因此甘蔗叶除杂方法选用样品经大孔树脂洗脱。 

2色谱条件的选择 

2.1色谱柱的选择 

分别采用不同的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在同一台高效液相色谱仪(美国Agilent1100Series：四元泵，自动进样器，柱温箱，紫外吸收检测器)上，取同一甘蔗叶供试品，在相同的色谱条件下进样分析，进样量为20μL，检测色谱图，结果见附图6、7、8。实验结果表明，除了AgilentC₁₈(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱外，其他各种品牌的色谱柱均可得到相似的色谱图。其中以AgilentC₁₈(5μm，4.6mm×250mm)分离效果最好，且稳定性好，故优选的最佳色谱柱为AgilentC₁₈(5μm，4.6mm×250mm)。 

2.2流动相系统的选择 

分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％冰乙酸水溶液、甲醇-0.2％冰乙酸水溶液系统对甘蔗叶的HPLC色谱图进行了考察。结果见附图9、10、11、12。相同条件下甲醇-水与乙腈-水梯度洗脱，后者色谱图中的色谱峰不但密集而且分离效果不好，故选定用甲醇-水洗脱后，加不同比例的冰乙酸，改善峰型，减少色谱峰的拖尾。结果表明甲醇-0.1％冰乙酸水溶液系统的效果最佳，采用该系统各个色谱峰的峰型和分离度均较好，因此选定该系统作为流动相。 

2.3检测波长的选择