[发明专利]利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，特别是涉及一种利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。

背景技术

2-酮基-D-葡萄糖酸是一种大规模生产的有机酸，其可以用作水泥增塑剂、洗涤剂，其钙盐可以用作食品添加剂用于增强钙，2-酮基-D-葡萄糖酸还可以作为前体用于合成杀虫剂、阿拉伯糖核糖等。目前发酵生产的2-酮基-D-葡萄糖酸主要直接用于合成D-异抗坏血酸，D-异抗坏血酸与L-抗坏血酸（维生素C）抗氧化作用相似，广泛用于食品添加剂替代L-抗坏血酸【Mei Chia,Thi Bich Van Nguyen,Won Jae Choi,DO-stat fed-batch production of2-keto-D-gluconic acid from cassava using immobilized Pseudomonas aeruginosa.Appl Microbiol Biotechnol(2008)78:759–765】。

利用荧光假单胞菌发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸主要采用流加批次发酵进行【孙文敬，赵峰梅，杨庆文，郭金权，秦丽，刘敬泽，补料分批培养生产2-酮基-D-葡萄糖酸的研究，食品科学，2004,25（11），115-117】。也有采用固定化细胞进行发酵的【Mei Chia,Thi Bich Van Nguyen,Won Jae Choi,DO-stat fed-batch production of2-keto-D-gluconic acid from cassava using immobilized Pseudomonas aeruginosa.Appl Microbiol Biotechnol(2008)78:759–765】。利用氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酮基-D-葡萄糖酸有利用静息细胞催化的方法进行生产的【陈鸿胜，李克非，舒行宙，刘浏，林金萍，魏东芝，基于Gluconobacter oxydans 膜结合脱氢酶的静息细胞催化合成2-酮基-D-葡萄糖酸，食品工业科技，2012,33（19），177-180】。

在克雷伯氏肺炎杆菌生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法中有利用连续培养进行发酵的【Hommes R,Postma P,Tempest D,Neijssel O(1989)The influence of the culture pH value on the direct glucose oxidative pathway in Klebsiella pneumoniae NCTC418.Archives of Microbiology151(3):261-267】。本发明人利用2,3-丁二醇合成途径缺失的克雷伯氏肺炎杆菌为生产菌株，利用葡萄糖为底物生产2-酮基-D-葡萄糖酸，具有较高的底物转化率（专利申请号201210476925.4）。但为了提高生产强度和产物终浓度，需要开发更为高效的生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。该方法具有较高底物转化率，并能获得较高产物终浓度。

为解决上述技术问题，本发明的利用克雷伯氏肺炎杆菌两段发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括：第一阶段主要进行克雷伯氏肺炎杆菌的菌体生长，第二阶段主要进行2-酮基-D-葡萄糖酸合成。

对于上述生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其步骤包括：

1）第一阶段发酵培养

配制培养基，灭菌后，在培养基中接入克雷伯氏肺炎杆菌进行好氧培养，并保持充足供氧以及在该培养过程中，利用碱控制发酵液pH处于中性或接近中性条件；其中，培养基包括：底物葡萄糖、氮源和无机盐；

氮源包括：酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸铵；无机盐包括：钠盐、镁盐、铁盐、磷酸盐和锰盐；

本步骤中，中性培养条件适宜菌体生长，能使菌体大量增加；

2）第二阶段发酵培养

第一阶段培养结束后，继续进行菌体的发酵培养，并停止或减慢碱的加入，利用菌体生长产生的有机酸使得培养基的pH逐渐降低到酸性条件或用酸调节发酵液处于酸性条件，然后用碱控制发酵液稳定于酸性条件；

本步骤中，酸性条件下菌体生长被抑制，菌体利用葡萄糖氧化生成2-酮基-D-葡萄糖酸；

3）在发酵培养过程中，当培养基中的底物葡萄糖消耗到0～50g/L时，补加葡萄糖。