[发明专利]检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒，以及检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤，在我国的发病率和死亡率均占男性泌尿生殖系统肿瘤的首位，且呈逐年上升趋势。膀胱癌患者初诊时30％已发生肌层浸润，而在非肌层浸润性膀胱癌患者中，仍有30%会复发为浸润性膀胱癌。早期诊断和早期治疗是预防和控制膀胱癌的关键。目前临床上诊断膀胱癌主要依赖于膀胱镜、尿脱落细胞学和影像学检查等。膀胱镜是膀胱癌诊断的常用方法，可造成不同程度的尿道和膀胱损伤以及感染等并发症；尿脱落细胞学检查具有非侵入性、特异性高等优点，其敏感性低于50%，对早期患者仅为30%，易受检测者主观因素的影响；CT和超声检查是目前诊断膀胱癌及术前分期最常用的影像学检查方法，但对膀胱内较小病变不易发现，对膀胱癌分期预测受到一定限制。寻找敏感性、特异性高的早期诊断生物标志物，建立一种经济准确、安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是目前关注的焦点。

miRNAs是在真核生物中发现的一类具有调控功能的内源性非编码小分子RNA，其通过对mRNA的完全和部分配对结合，降解mRNA或干扰mRNA的翻译，在转录后水平调控特定基因的表达，从而对细胞增殖、分化与凋亡起到精细调节的作用。近年来研究发现，尿液中存在丰富稳定的miRNAs，其与泌尿系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关，为肿瘤的无创性诊断开辟了一条新的途径。并且，随着分子生物学技术的发展，通过实时荧光定量PCR方法检测尿液中微量的miRNAs已成为可能。所谓实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时监测PCR的进程，最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析。由于该技术操作简便、敏感性高、重复性好，目前已在核苷酸检测领域得到广泛应用。

miRNA-155为癌基因BIC的表达产物，其在造血细胞分化、免疫、肿瘤及心血管等疾病各种生理或病理过程中起着重要的调控作用。2005年Iorio应用微阵列芯片技术首次筛选出乳腺癌异常表达的miRNAs谱，发现miRNA-155是上调最明显的miRNAs之一。Zhu等发现miRNA-155的表达水平较正常乳腺组织显著上调，并且其与乳腺癌的TNM分期、淋巴结转移、雌激素受体、孕激素受体呈明显相关。近年来，随着研究的不断深入，发现miRNA-155在肺癌、胰腺癌、肾癌以及头颈部肿瘤中表达均明显升高，并且与肿瘤细胞的增殖、浸润及转移具有密切关系，表明miRNA有可能成为一种良好的肿瘤标志物分子。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒及检测方法，能够快速、简便、准确的检测膀胱癌尿液中miRNA-155的表达量。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，包括：

（1）miRNA-155的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示：

miRNA-155-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’；

miRNA-155-F：5’-CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’；

miRNA-155-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

（2）miRNA-191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示：

miRNA-191-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’；

miRNA-191-F：5’-GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’；

miRNA-191-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

（3）miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示：

miRNA-16-RT：