[发明专利]用于高效乳酸生产的材料和方法

说明书

本申请是申请日2006年8月10日、标题为“用于高效乳酸生产的材料和方法”申请号200610109332.9的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2005年8月10日提交的美国临时申请系列号第60/706,887号、2006年1月24日提交的系列第60/761,576号、以及2006年5月11日提交的系列号第60/799,619号的权益。

政府支持

本发明是在政府的支持下完成的，其由能源部资金支持，批准号为USDOE-DE FG02-96ER20222；以及由能源部联合美国农业部资金支持，批准号为USDA&DOE Biomass RDI DE FG36-04GO14019。本发明还得到来自美国农业部的政府支持，批准号为01-35504-10669和00-52104-9704。政府对本发明具有一些权利。

背景技术

乳酸通常用作用于保存、增加风味和酸味的食品添加剂。乳酸还用于制造可生物降解塑料，即聚乳酸(PLA)。PLA作为石油基产品的可更新替代品的应用迅速扩大(Agrawal,2003)。PLA的物理性能和生物降解速率可通过调整手性底物(D-乳酸和L-乳酸)的比率加以控制(Narayanan et al.,2004)。估计每年全球乳酸市场超过100,000吨，并且有望在接下来的几年内随着新的PLA设备投入运行会有显著增长。

例如，对可生物降解的溶剂乳酸乙酯(一种乳酸衍生物)的需求有望在近年内有显著增长。据估计，乳酸酯有可能代替美国每年使用的380万吨溶剂的80%。这种溶剂无毒并且具有许多有益的应用，包括用于电子制造、油漆和涂料、纺织品、清洁剂和脱脂剂、粘合剂、印刷、以及脱墨。

生产乳酸时，人们常常优选发酵方法而非化学合成，因为其得到的是D和L异构体的混合物。微生物发酵的产物依赖于所使用的有机体。微生物发酵可产生两种异构体的混合物或者立体专一形式的光学纯乳酸。希望的产物的立体专一性依赖于其计划的用途。

采用乳酸杆菌(Lactobacilli)的细菌发酵通常用于乳酸的工业生产，但是这些发酵很少产生光学纯产物。另外，这些细菌需要复杂营养的性质要求将相当大量的补充营养素添加到生长培养基，增加了额外费用并且使纯化更加困难。此外，用于生产乳酸的发酵方法效率严重不足，必须加以改进以确保上述预期市场扩张的经济可行性。

尽管描述过重组酿酒酵母菌(Saccharmyces cerevisiae)菌株含有来自乳酸杆菌或者牛源(bovine origins)乳酸脱氢酶(ldh)基因(Patent WO99/14335and Adachi et al.,1998)，但是酵母菌不能生产可观水平的乳酸。虽然能够生产达2-4%(w/v)的乳酸，但是这些菌株显示出较差的生产能力并且相当一部分葡萄糖转化成乙醇。

丝状真菌米根霉(Rhizopus oryzae)(也称作少根霉(R.arrhizus))也用于乳酸的工业生产。米根霉能够在化学成分确知的培养基(chemically defined medium)中将葡萄糖有氧地(aerobically)转化为大量的光学纯L-(+)-乳酸。之所以持续研究通过根霉的乳酸生产，主要是因为在基本生长培养基中容易进行产物纯化以及真菌利用复合碳水化合物和戊糖的能力(美国专利第4,963,486号)。这使得可利用真菌将低价值的农业生物质转化为乳酸。遗憾的是，通过对根霉和其它真菌的遗传修饰来改变乳酸生产的能力比较有限。

基于大肠杆菌K-12的生物催化剂已经被改造用于D-(-)-乳酸(盐)(lactate)生产，但是不能将复合或基本培养基中10%的葡萄糖或蔗糖发酵完全(Chang et al.,1999;Dien et al.,2001;Zhou et al.,2003;Zhu and Shimizu2004)。

人们开发了一种大肠杆菌生物催化剂，即SZ63(pLOI3501)，其通过在质粒上功能化地表达来自大肠杆菌B的cscR’cscA’cscKB’基因而用于蔗糖发酵(Shukla et al.2004)。尽管能够有效地发酵5%的葡萄糖或蔗糖，但是这种生物催化剂不能彻底代谢更高的糖浓度并且为了质粒的维持需要连续进行抗生素选择。