[发明专利]适于大规模生产流感疫苗的无血清培养基

说明书

技术领域

本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种适于动物细胞大规模微载体悬浮培养以及病毒扩增生产疫苗（大规模生产流感疫苗）的无血清培养基。

技术背景

世界卫生组织（WHO）的数据显示：全世界每年约有5～15%的人感染季节性流感，其中会有300～500万个严重病例，有高达25～50万人死亡。流感给人类造成的损失不仅仅是超额的死亡率，更涉及到各种形式的直接或间接的经济损失；其中，直接的经济损失包括医院成本、医药消费增加以及企业因工作缺勤率而导致效率低下等；有人在1999年就统计过，流感每年给美国造成的直接经济损失高达1000亿美元。而间接损失包括直接经济损失的放大效应及流感引起的基本经济行为、投资行为和消费行为的变化等等，这些损失是无法估量的。

目前公认的预防流感的最佳方法是接种流感疫苗。对大多数国家和地区而言，安全有效的灭活疫苗一直是预防流感的基础。在发达国家，若能保证疫苗的抗原性与流感易发季节有较高的匹配度，便可保护70%～80%的健康成人免于出现流感临床症状。对于未居住在养老院、护理机构的老人，在流感易发季节接种疫苗后不仅可减少25%～39%的住院人数，而且可使总死亡率降低39%～75%。因此，流感疫苗已成为当今受人重视的、销售额最大的疫苗品种之一。有研究表明，流感疫苗是过去10年中疫苗市场增长的主要推动者，也是未来10年疫苗市场增长的主要品种之一。目前就世界范围而言，流感疫苗的接种率还比较低，但是，随着各国生活水平的提高，流感疫苗的接种率会持续增长，对流感疫苗的需求将持续扩大。

目前，流感疫苗的制备多采用传统的鸡胚培养工艺。但是，该工艺是一种劳动密集型工艺，存在诸多缺陷，例如：第一，对鸡胚的要求严格，必须是SPF（Specific Pathogen Free 无特定病原）级洁净鸡胚。因此，准备合格鸡胚所需要的周期长，对流感大流行的应急能力差。第二，所饲养的种鸡个体的差异可能导致鸡胚存在差异，使得各批次疫苗间的质量均一性差。第三，疫苗的生产过程时间长、易污染。此外，鸡胚生产的疫苗还可能导致对鸡蛋过敏的人群发生严重的超敏反应。

因此，克服现有技术的不足，研究基于细胞培养的可高效生产流感疫苗的体系成为目前流感疫苗研制的重要方向之一，世界卫生组织及各国相关部门也在积极倡导利用细胞培养技术生产疫苗，以替代鸡胚培养工艺。

近年来，将各种动物细胞用于疫苗生产的研究也在不断推进之中。有大量文献报道了：MDCK细胞（Madin-Darby canine kidney cells）被广泛用于病毒的扩增和纯化，因其增殖快，且流感病毒对其感染效率高、不易变异，因此被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一。

目前，基于动物细胞（MDCK细胞）培养流感疫苗的生产过程多采用两阶段操作工艺，即：前期在有血清的培养基中使细胞增殖至所需密度；后期通过洗涤去除血清成分及代谢废物，更换为无血清培养基以支持病毒在细胞中感染和复制。然而血清的应用可能存在很多问题：例如：第一，批次间组分和质量的差异易造成生物制品批次间质量的不均一；第二，易污染支原体、病毒、BSE-因子和其它传染因子的风险；第三，大量血清蛋白的存在增加了后期分离纯化的难度，并且部分物质无法彻底去除，会影响最终产品的质量；此外，血清来源受限、价格昂贵，大大增加了生产成本。因此，许多研究组织都在开发无需血清的培养条件或者血清来源产品的有效宿主系统。

在细胞增殖的方式中，悬浮培养模式因具有规模易放大、培养条件易控制等优点，大规模的细胞增殖多采用该模式。悬浮培养模式又分为微载体悬浮培养和单细胞悬浮培养方式。前者与后者比较具有一定的优势：首先，易更换培养基，无需专用细胞过滤器，可避免滤器堵塞等问题；其次，细胞与培养液易分离，易于洗涤细胞；再次，便于浓缩细胞密度，易制备高浓度、高效价生物产品，可降低产品分离纯化成本；最后，细胞可保持贴壁生长属性，避免悬浮细胞引起的致瘤性等安全问题。因此，目前流感疫苗的生产工艺中多采用微载体悬浮培养的模式。

综上所述，在基于MDCK细胞通过微载体悬浮培养的模式大规模培养并生产流感疫苗的工艺中，无血清培养基的开发和应用具有非常重要的意义。

近年来，对无血清培养基的研究已取得了一些长足的进展：