[发明专利]基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法。 

背景技术

转座元件（transposable element），是广泛分布于真核生物中的一类可移动的DNA片段，最早由美国冷泉港生物实验室著名遗传学家B.Mc Clintock在玉米中发现。MITE（miniature inverted repeat transposable element），即为转座子，是Bureau等新近发现的一类转座元件，其结构与非自主元件相似，具有TIR或TSD结构，但又具有反转录转座元件的高拷贝性。MITE广泛分布在植物和动物的基因组中，并且多存在于基因富集区，推测其对基因组进化和基因表达等具有较大的影响。目前，MITEs已在许多生物体中发现,如水稻、秀丽隐杆线虫、蚊子、人、真菌。 

MITE的长度较短，一般为100～700bp，不能编码转座酶。它具有末端倒转重复序列（terminal inverted repeats，TIRs）和靶位点重复（target siteduplication，TSD），并且能形成稳定的发夹式的二级结构。它倾向于插入到基因的内含子区或基因的5′和3′末端，但很少插入基因编码区，有的也能形成巢式结构。不同的MITE家族具有他们特异的TIRs和TSD。根据TSD序列的保守性，植物中的MITE被分为Tourist（具有3bp的TSD，TAA或TTA）和Stowaway（2bpTSD，TA）两大类。TIR是确定MITE不同家族的主要依据， 不同物种的MITE元件TIR序列具有同源性。 

MITE拷贝数多，本身具有多态性并能产生插入多态性，可以揭示出种内和种间丰富的多态性信息，在遗传多样性和系谱分析研究中是一种有效的分子标记，具有一定的开发潜力。MITE在基因组中拷贝数很高，不同的MITE亚族成员具有成百上千个拷贝甚至更高。MITE以多拷贝分布在植物的各条染色体中，因此被视为进行精细多态性及遗传关系分析的良好工具。 

CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)方法是一种DNA提取经典方法，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种MITE特异性引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法,并且该检测方法新颖、灵敏度高、特异性强。 

本发明的技术方案如下：一种基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，按照如下步骤完成： 

（1）、用CTAB方法提取家蚕样本微孢子虫的基因组DNA； 

（2）、用MseI酶完全消化步骤（1）所得的家蚕样本微孢子虫的基因组DNA，并与接头引物混合连接，形成连接混液，具体反应为0.5ml离心管中加入下列反应物并且混合均匀： 

接头引物：5′-CAGGGTGGGCAAA-3′            SEQ NO 1； 

（3）、将步骤（2）所得的连接混液取1μl，在以下25μL反应体系中进行预扩增： 

A.在0.5ml离心管中加入以下反应物并且混合均匀： 

PCR反应扩增的引物： 

NbME5特异引物：5′-AAAGTTTGCCCACCCCTG-3′          SEQ NO 2 

NbME1特异性引物：5′-CCCTTGGGAAACACTG-3′          SEQ NO 3 

（4）将步骤（3）所得的预扩增产物稀释20倍后，再进行第二轮PCR扩增的DNA模板，对稀释后的产物加入锚定引物和NbME特异性引物后，在20μL体系下进行扩增。反应体系如下： 

A.在0.5ml离心管仲加入下列反应物并且混合均匀 

NbME5特异引物：5′-AAAGTTTGCCCACCCCTG-3′          SEQ NO 2 

NbME1特异性引物：5′-CCCTTGGGAAACACTG-3′          SEQ NO 3 

锚定引物1：5′-CAGGGTGGGCAAACT-3′                 SEQ NO 4 

锚定引物2:5′-CAGGGTGGGCAAACA-3′                  SEQ NO 5