[发明专利]壳寡糖作为昆虫几丁质酶抑制剂及杀虫剂的应用

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及到一种壳寡糖作为昆虫几丁质酶抑制剂及壳寡糖杀虫活性方面的应用。

背景技术

自从人类学会了耕作，就开始了与农业害虫的斗争。杀虫剂是控制农业害虫的主要手段之一，全球每年依靠杀虫剂的使用能够挽回农业害虫造成损失的30%～35%。然而，目前商品化的杀虫剂主要针对乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体等少数几个靶标，存在严重的抗性问题。因此，必须开发针对新靶标的杀虫剂。

几丁质是构成昆虫体壁，气管和围食膜的主要结构成分，在昆虫生长发育的过程中必需不断的进行合成与降解。同时，几丁质不存在于植物、哺乳动物和人类体内。因此，昆虫几丁质代谢相关酶是“绿色”的杀虫剂靶标。几丁质酶是昆虫几丁质水解过程的关键酶。对昆虫几丁质酶的RNA干扰证实该酶表达量下调会引起昆虫生长发育异常而死亡，Zhu et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA。因此，昆虫几丁质酶抑制剂是潜在的“绿色”杀虫剂。

目前已报道几丁质酶抑制剂主要是天然产物allosamidin、argadin及argifin等，这些化合物虽然抑制活性较好，但无论天然提取还是全合成均非常困难且成本较高。最近报道的通过高通量筛选获得的甲基黄嘌呤衍生物等，这些化合物抑制活性较差而且合成成本较高。因此，非常有必要开发更经济、实用的几丁质酶抑制抑制剂。

壳寡糖是由2-20个氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的寡聚糖，也是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基寡糖，具有水溶性好、安全无毒等优点。壳寡糖因其结构的特殊性，在营养与保健、畜牧养殖、植物生长调节及抗病害等方面具有广泛的应用。但到目前为止，壳寡糖选择性抑制几丁质酶的活性还尚未有报道。由于壳聚糖与几丁质具有相似的结构，如附图1所示。申请人推测壳寡糖能够与活性口袋结合抑制几丁质酶的活性，进而体现出杀虫活性。

亚洲玉米螟是我国玉米最主要的害虫，每年造成玉米减产10%～30%，还能危害棉花、高梁、谷子和大麻等农作物。申请人已经克隆了亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的基因，GeneBank登录号：DQ294305，该基因在亚洲玉米螟化蛹之前表达量显著上调。对赤拟谷盗中同源基因TcCht5的RNA干扰会引起昆虫变态发育异常而死亡，Zhu et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA。申请人在毕赤酵母中实现了OfCht5的高活性重组表达，为昆虫几丁质酶抑制剂的筛选提供了前提和基础，Wu Q, et al. Insect Sci, 2012。

发明内容

本发明提供了一种壳寡糖在昆虫几丁质酶抑制剂及杀虫剂的应用方法。

本发明解决技术问题采用的方案如下：

壳寡糖，包括二种：一种是聚合度为2-6的氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的单体，另一种是聚合度为2-20的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的混合物。

本发明提供了壳寡糖单体水溶液作为昆虫几丁质酶抑制剂的应用。聚合度为2-6的壳寡糖单体水溶液在体外均能抑制亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的活性，其中以壳6糖的抑制活力最高，其抑制常数为24.3 μM（表1）。

表1 不同聚合度壳寡糖的对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的抑制常数

等温量热滴定表明聚合度为2-6的壳寡糖单体均能与亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5结合（图3-7）。一分子的OfCht5能够结合两分子的聚合度为2和3的壳寡糖，但是只能结合一分子的聚合度为4和6的壳寡糖（表2）。

表2 不同聚合度壳寡糖单体对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合活性

本发明提供了壳寡糖混合物作为杀虫剂的应用。壳寡糖混合物可以制备液体制剂或固体制剂。液体制剂可以是农用的任意液体制剂，优选的可以为水剂、微乳剂或悬浮剂；固体制剂可以是农用的任意固体制剂，优选的可以为可湿性粉剂或颗粒剂。其中，用于杀水生害虫如库蚊幼虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.0005%；用于杀陆生害虫如亚洲玉米螟幼虫的制剂壳寡糖混合物的含量需大于0.006%。壳寡糖混合物水剂对于不同种属昆虫的杀虫活性如表3所示。

表3 壳寡糖混合物的杀虫活性

附图说明

图1 几丁质和壳聚糖的化学结构。

图2 壳寡糖混合物HPLC图谱。

图3壳2糖对亚洲玉米螟几丁质酶OfCht5的结合活性。