[发明专利]导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法

权利要求书

1.导致西瓜两性花发育的基因a，其特征在于：具有序列表中的SEQ ID NO:1～6的核苷酸碱基序列。

2.导致西瓜两性花发育的基因a，其特征在于：具有翻译为序列表中的SEQ ID NO:7～8的氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。

3.导致西瓜两性花发育的基因a基因序列的获得方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A、供试材料选取：

选取供试体材料；

B、基因组DNA的提取：

将所述的供试材料分别进行DNA提取处理，得到供试材料基因组DNA；

C、长距离PCR扩增反应与产物的检测：

以所述的供试材料基因组DNA为模板，进行长距离PCR扩增反应，得到长距离扩增产物；

D、特异性扩增序列的获得：

将所述的长距离扩增产物进行纯化处理后与质粒载体进行连接反应，得到重组质粒；再将所述的重组质粒转入感受态细胞，再进行筛选、检测、测序，得到特异性扩增序列；

E、候选SNP的获得：

将所述的特异性扩增序列的核苷酸序列进行分析比对并结合内含子剪切预测结果，得到候选SNP位点；

F、对所述的候选SNP位点进行验证，获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列。

4.根据权利要求3所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，其特征在于：

步骤C的长距离PCR扩增反应中，

上游引物的核苷酸序列：

5’-CCAATTTCTATCAAATATGGGCAATG-3’，

下游引物的核苷酸序列：

5’-TCTCTGGATCTTAAAACCCGATT-3’。

5.根据权利要求3或4所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，其特征在于：

步骤C的长距离PCR扩增反应中，反应程序为：

阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃30s，55℃30s，68℃2min，共10个循环；阶段3：94℃30s，55℃30s，68℃2min，第一个循环的时间为2分钟，从第二个循环开始，时间在前一个循环的基础上增加5秒，共25个循环；阶段4：68℃延伸10min；阶段5:4℃保存。

6.根据权利要求3所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，其特征在于：步骤F中的验证中，利用基因标记a_dCAPs进行PCR扩增反应中，

上游引物的核苷酸序列：

5’-CAATAACGGGCTTAAATTCATCCG-3’，

下游引物的核苷酸序列：

5’-CATGTTGTCGAACCGGAAGTTTAC-3’。

7.根据权利要求3或6所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，其特征在于：步骤F中的验证中，利用基因标记a_dCAPs进行PCR扩增反应中，反应程序为：

反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；阶段3：72℃延伸8min；阶段4：4℃保存。

8.根据权利要求7所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，其特征在于：步骤F中的验证，酶切反应采用的DNA内切酶为FspBI。

反应程序为：将步骤F所得PCR产物37℃酶切12-16个小时，再68℃变性20min，于4℃保存。