[发明专利]一种结核分枝杆菌TB检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种结核分枝杆菌（TB）检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的TB-DNA检测试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌是结核病的病原菌，本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见；目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡；我国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多；因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。

目前我国对结核病的临床诊断主要通过痰涂片镜检和细菌分离培养。痰涂片镜检法简单、快速，但灵敏度和特异度都达不到要求，而且受实验室条件、实验人员镜检技术水平的影响较大；此外，涂片法的检测精度大约为50%且无法检出耐药菌株。细菌分离培养是结核病诊断的金标准，但耗时长，快速生长菌也至少需7天才有阳性结果，时间长者甚至需要数周，而且由于标本处理过程可能导致细菌死亡，产生假阴性结果。另外，免疫学和血清学技术也因其低灵敏度和特异性而受到限制。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测结核分枝杆菌，主要包括PCR诊断、DNA指纹技术等。而随着FQ-PCR技术的发展，其在结核病早期诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，结核病感染的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。

运用荧光PCR技术检测TB-DNA主要包括TB核酸的提取和核酸的PCR扩增两方面。

目前国内临床上主要采用直接煮沸法对样本中的TB核酸进行提取，该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，样本中的DNA存在损耗，尤其对高浓度的样本裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低。国外临床上主要采用某种DNA提取试剂盒来提取TB核酸，其提取效果较好，但是由于价格昂贵，难以在国内应用。

临床上检测TB-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定量检测。与传统的PCR相比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术定量检测TB-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒多半以煮沸法提取核酸，且其检测灵敏度不高，约在1-10个TB菌左右。

发明内容

本发明提供一种核酸释放剂在结核分枝杆菌TB检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%。

在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在结核分枝杆菌TB检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该菌检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。

本发明提供一种结核分枝杆菌TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。