[发明专利]一种布拉氏酵母菌表面展示系统及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白表面展示系统，具体提供了一种能够表达展示异源蛋白质的布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)表面展示系统及其构建方法。

背景技术

布拉氏酵母菌是法国科学家亨利(Henri Boulard)于1920从印尼荔枝等水果中分离的一种非致病性酵母菌。自1982年Ducluzeau等首次发表布拉氏酵母菌作为益生菌的实验结果以来,对布拉氏酵母菌的抗毒止泻、维持宿主胃肠道微生态平衡、提高机体非特异性免疫力的临床试验和研究越来越多。布拉氏酵母菌现已被公认为最为有价值的益生菌之一，被世界许多国家广泛应用于医学临床和畜牧业生产中。目前，布拉氏酵母菌作为微生态制剂在欧美等广泛用于防治儿童和旅行者的各种腹泻如梭状芽孢杆菌、霍乱弧菌、轮状病毒等感染和抗生素引起的肠炎所致的腹泻。其制剂应用于畜牧业，可有效降低病原菌和有关毒素的浓度，增强非特异性免疫功能，提高生产性能。作为饲料添加剂的应用已得到包括中国、欧盟在内的世界许多国家的认可。随着人们对健康和生态环境的高度重视及在畜禽养殖中的进一步研究，布拉氏酵母菌在医学和畜牧业中必将有更广阔的应用前景。

然而，对于布拉氏酵母菌的研究，一直以来主要集中在临床应用方面，而针对布拉氏酵母菌的作用机制，特别是在分子水平上的作用机制，以及对布拉氏酵母菌的遗传改造等却少有研究和报导。究其原因，主要是因为目前尚没有一整套有效的适用于布拉氏酵母菌的分子遗传学技术操作体系。虽然最近的一系列研究表明，布拉氏酵母菌是酿酒酵母的变异株或亚种，然而布拉氏酵母菌也有作一些完全不同于酿酒酵母的生物学、生理学、代谢及遗传学特性，如不能利用半乳糖作为碳源、第9染色体为3倍体、对低pH和温度有较高的耐受性、氮缺乏时可在一定程度上转化成假丝等，特别是布拉氏酵母菌是野生的菌株、双倍体、无营养缺陷型且不能孢子化。因此，适用于酿酒酵母的技术体系和方法无法直接应用于布拉氏酵母菌。这直接限制了对布拉氏酵母菌进行分子生物学、遗传学等方面全面深入的研究，以至于对布拉氏酵母菌从基因水平上进行遗传改的设想，由于缺乏有效的分子遗传学技术操作体系而无法实现。

与噬菌体和细菌表面展示相比，酵母菌表面展示系统具有糖基化作用、蛋白翻译后折叠与高等真核动物类似，更利于高效表达具有生物活性的复杂蛋白。此技术已成功应用于筛选特异配体、绘制抗原表位图谱，生产活菌体疫苗、全细胞催化剂，和蛋白的定向进化等。作为益生菌，布拉氏酵母菌的表面展示系统在国内外尚未见任何的研究和报导。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种以布拉氏酵母菌为表面展示平台表达外源蛋白质的表面展示系统，本系统从布拉氏酵母菌，购自法国百科达制药厂，进口药品注册证号为s20040038，的DNA组中扩增得到AGA1基因以及AGA2基因，并以pPIC9AGA2质粒为模板扩增AGA2基因表达核,用布拉氏酵母菌的AGA2基因替换AGA2基因表达核的AGA2基因。将获得的AGA1基因和替换后的AGA2基因表达核连接到基础质粒pSP上，分别在超表达启动子TEF1和PGK1控制之下，由此得到能够在布拉氏酵母菌表面表达的通用表面展示表达质粒pSDSb。本发明能够持续表达和该通用质粒pSDSb的Aga2p的C端融合的异源蛋白质并展示在布拉氏酵母菌的表面，从而超表达某些异源蛋白，将其作为病原活疫苗载体和研究蛋白与蛋白之间的相互作用具有其它微生物载体不可取代的作用。

本发明所提供的系统以pSP为基础质粒构建布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒，将AGA1基因的，其基因序列如Seq ID No:8所示，AGA2基因表达核，其基因序列如Seq ID No:10所示，克隆到基础质粒pSP上，由此得到能够在布拉氏酵母菌表面表达的通用表面展示表达质粒pSDSb。异源蛋白与该通用质粒的Aga2p的C端融合从而表面展示在布拉氏酵母菌细胞壁上。

上述的表达质粒pSDSb转化布拉氏酵母菌后，质粒中的Aga1p（AGA1基因表达的蛋白）通过GPI锚定在细胞壁上，Aga2p（替换后的AGA2基因表达核表达的蛋白）的N端通过两个二硫键与Aga1p连接，异源蛋白通过与Aga2p的C端融合从而表达展示在布拉氏酵母菌细胞壁上。