[发明专利]一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌菌群结构的解析方法，尤其是指利用特定rDNA长片段来进行解析。

背景技术

DGGE（变性梯度凝胶电泳）和TGGE（温度梯度凝胶电泳）是两种基于DNA片段序列差异的电泳技术，目前已经成为微生物分子生态学的重要手段，被广泛用于菌群多样性研究。这两种技术可以分离长度相同但序列不同的DNA片段，其分离原理基本一致——是依靠双链DNA在含有化学变性剂梯度（DGGE）或者温度梯度（TGGE）的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为来实现的。各种类的微生物都拥有其特有的rDNA序列，这些序列可以作为它们的标识，并且均可以通过DGGE和TGGE进行分离。因此这两项技术通常和rDNA分子鉴定技术相结合用于将微生物菌群多样性信息转化为微生物菌群结构信息。而对于真菌菌群结构的解析而言，常采用18S rDNA序列或ITS序列上的某一段可变区做为目标片段。

上述两项技术虽然是微生物生态研究中解析菌群多样性的重要手段，但是它们也存在着难以分析长片段（>500bp）的不足，这对于菌群结构信息的准确获取是十分不利的。具体来说，DGGE和TGGE均对200-500bp的DNA片段具有较好的分离效果，超过500bp则分辨率都会显著下降——这样就会影响到菌群多样性的解析。虽然小于500bp的短片段有利于DGGE和TGGE的分离，但是这样的片段却无法满足之后分子鉴定的需要。因为这样的片段（200-500bp）携带的序列信息有限，即使是500bp也分别只占到作为常用的真菌分子鉴定标准——18S rDNA全长序列的1/4和ITS序列的2/3左右，因此往往无法获得精准的分子鉴定结果。

发明内容

为了克服上述DGGE和TGGE技术在真菌菌群结构解析中的不足，本发明提供了一种基于特定rDNA长片段的分析方法：可以在保证分离效果的情况下，同时获得18S rDNA近全长序列和ITS序列用于分子鉴定，因此将会得到十分精准的真菌菌群结构信息，这样DGGE和TGGE技术就可以更加有效地用于真菌菌群结构的解析。准确获知样品中微生物种属信息是微生物生态研究中最基本也是最重要的一环，因此本发明对真菌菌群结构研究领域具有较大的意义。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，所述特定rDNA长片段是指一段包含18S rDNA近全长序列和ITS序列的片段（图1），它是由靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的；所述18S rDNA近全长序列是指一端起始于引物NS1对应区域直至另外一端的序列，长约1780bp，相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的20-1800位点；所述靶向ITS序列的下游引物必须与NS1构成引物对特异性地扩增两者结合位点之间的片段，并且扩增片段长度大于2000bp。

本发明用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构时采用的是DGGE或TGGE技术。

所述方法包括如下步骤：

a、提取样品中微生物总基因组DNA；

b、采用靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增所述特定rDNA长片段；

c、将步骤b中扩增的特定rDNA长片段进行DGGE或TGGE分析；

d、割胶回收特定rDNA长片段条带，采用同样的引物扩增特定rDNA片段全长序列或者分别采用靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对扩增其包含的18S rDNA片段和ITS片段；所述同样的引物是指步骤b中用于扩增特定rDNA长片段的引物；

e、将步骤d中获得的特定rDNA长片段或者18S rDNA片段和ITS片段进行测序，再将测定的18S rDNA序列和ITS序列分别提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，最终结合两者的结果综合判定对应菌株的种属。

其中，关于靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对的选取，是将扩增特定rDNA长片段所采用的靶向18S rDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物分别作为靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对之一。

其中，对特定rDNA片段进行直接测序，如前所述可以得到长约1780bp的18S rDNA序列和剩下的ITS序列。