[发明专利]一种由口服基因工程发酵酵母介导的小鼠肠道DC细胞表达外源和内源基因的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫学和基因工程技术领域，涉及一种由口服基因工程发酵酵母介导的小鼠肠道DC细胞表达外源基因和内源基因的方法及其应用，具体涉及应用基因工程发酵酵母向动物小肠树突状细胞内靶向运送功能基因片段，并获得基因表达同时影响树突状细胞功能或者诱导机体产生特异性抗体的方法。 

背景技术

树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)分布于机体所有组织和器官，是目前己知的机体内功能最强大的抗原提呈细胞(Antigen Present Cell，APC)，是连接天然免疫和获得性免疫的重要桥梁，同时具有激活免疫应答和诱导免疫耐受的双重功能。树突状细胞的免疫功能与其成熟状态密切相关，成熟DCs具有很强的抗原提呈功能，激活免疫应答;未成熟DCs主要功能为摄取、处理和加工抗原，不能提供共刺激信号，从而诱导免疫耐受。DCs在诱导初次免疫应答中又具有独特的功能，它将抗原提呈给初始T细胞(T-cell)，激发初始免疫应答，其抗原提呈能力远远强于单核细胞、巨噬细胞和B细胞。DCs能有效地激活、诱导初始T细胞，引发机体的免疫应答或免疫耐受，在免疫调节中的作用受到广泛的关注。DCs的功能在自身免疫疾病方面起着很重要的作用。 

Stubbs等人(2001)曾经证明小鼠口服的重组酵母能够特异性的进入小肠树突状细胞，酵母中表达的重组蛋白能够诱导小鼠特异性免疫反应。 

小鼠同源基因β-catenin是一种细胞粘附分子，为细胞内糖蛋白，参与细胞的信号转导，在细胞粘附、生长、增殖和细胞转归过程中起重要作用。其中Wnt/β-catenin信号途径是目前最受关注、最具特征性的Wnt信号通路，它可能参与调控DCs的分化成熟和免疫功能。以β-catenin为中心的经典通路,正常情况下胞内β-catenin被Axin/APC/GSK3β等组成的复合物所降解,而经典通路活化后能阻止降解复合体的形成,引起胞内游离β-catenin的积累。β-catenin入核后活化下游转录因子TCF/LEF,激活靶基因表达。已有实验证明β-catenin在胞内的积累能引起DCs表型的成熟。 

发明内容

本发明解决的问题是应用基因工程发酵酵母向动物小肠树突状细胞(DCs)内靶向运送功能基因片段，并获得表达，在DC细胞中表达的基因，可以用来调控DC细胞的功能，达到治疗DC细胞相关疾病的目的；或者通过DC细胞诱导动物产生特异性免疫反应，用来开发新型DNA疫苗。所述基因工程发酵酵母含有真核基因表达盒（如CMV-β-Catenin或者GFP-SV40pA)：真核基因表达盒可以整合在酵母基因组或者作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。应用该基因工程酵母饲喂6周龄FVB小鼠，5天后分离FVB小鼠肠道DC细胞可检测到目的基因的表达；口服免疫35天后，能够在小鼠血清中检测到特异性抗体的产生。本发明应用基因工程酵母作为功能基因运送载体，靶向调控哺乳动物肠道免疫细胞（树突状细胞）的功能，能够应用于治疗自身免疫疾病和新型口服疫苗开发和生产。 

本发明的目的在于公开了一种由小鼠肠道DC细胞表达外源基因和内源基因的方法。 

本发明的另一个目的在于公开了上述方法的应用。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一种由口服基因工程发酵酵母介导的小鼠肠道DC细胞表达外源基因和内源基因的方法，包括给小鼠口服基因工程发酵酵母的步骤，其中，所述基因工程发酵酵母为含有真核细胞表达载体的基因工程发酵酵母；所述真核细胞表达载体包含真核细胞启动子、功能基因cDNA或RNA干扰序列以及polyA信号片段，其中真核细胞启动子选自CMV、SV40、pCAG、hsp70、CIITA-pI、CD11c、H1或U6启动子中的一种；所述功能基因cDNA或RNA干扰序列选自β-Catenin、细菌、病毒抗原基因、GFP、β-Catenin或CD40的RNA干扰序列中的一种；所述polyA信号片段选自为SV40polyA或actin polyA。 

上述技术方案所述的由口服基因工程发酵酵母介导的小鼠肠道DC细胞表达外源基因和内源基因的方法，其中，所述功能基因为下述(Ⅰ)或(Ⅱ)： 

(Ⅰ)、内源小鼠β-Catenin基因，所述基因工程发酵酵母为转化了真核细胞表达载体JMB84-CMV-β-catenin-HA-T2A-GFP-polyA的JMY1酵母，所述真核细胞表达载体JMB84-CMV-β-catenin-HA-T2A-GFP-polyA包含了真核细胞启动子CMV、功能基因β-Catenin和polyA信号片段；或