[发明专利]人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种人胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的二串体蛋白及其构建方法、制备方法，以及该二串体蛋白的表达、纯化及鉴定、在体外的生物学活性检测等方面。

背景技术

胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)是胰高血糖素原基因(proglucagon，PG)衍生肽类(PGDP)之一，为PG转录、翻译后处理加工的含33个氨基酸的多肽，其氨基酸残基序列为：HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。PG在胰腺A细胞和肠道L细胞都有表达，但其表达产物却因为组织特异性的加工修饰而不同。在胰腺主要产生胰高血糖素，而在肠道内主要产生PGDP(1-160个氨基酸)，PGDP主要包括GLP-1、GLP-2、肠高血糖素、胃泌酸调节素等，而GLP-2定位于第126-158位氨基酸。

GLP-2和GLP-1一样由小肠和大肠的内皮细胞分泌，GLP-2的生物学活性包括：促进小肠和大肠粘膜生长、抑制肠和隐窝细胞凋亡、促进肠内葡萄糖运输和GLUT-2表达、增加营养吸收、抑制胃排空和胃酸分泌、降低肠通透性、增高肠血流量等。除此之外，GLP-2还可促进大鼠星形胶质细胞增殖和抑制骨吸收。鉴于GLP-2的上述生物学活性，其被开发用于短肠综合征、肠型放射病等疾病的治疗。值得注意的是，GLP-2只有以完整形式(1-33)存在时才有生物学活性，其在体内的半衰期只有7min，可被二肽激酶4(DPP4，又称为T细胞表面抗原CD26、DPPIV等)通过识别并水解N末端的Ala而成为无活性的GLP-2(3-33)，并经由肾脏排出。GLP-2通过其特异性受体GLP-2R来发挥作用，GLP-2R下游的分子机制涉及多条信号通路，目前还没有完全明确。

1GLP-2的生成和降解

GLP-2是胰高血糖素原(PG)基因的表达产物，是胰高血糖素原衍生肽类(PGDP)之一。PG基因在胰腺A细胞和肠道L细胞都有表达，但其表达产物却因为组织特异性的加工修饰而不同。在胰腺主要产生胰高血糖素，而在肠道内主要产生PGDP(1-160个氨基酸)，PGDP主要包括GLP-1、GLP-2、肠高血糖素、胃泌酸调节素等，而GLP-2定位于第126-158位氨基酸。

GLP-2在各种哺乳动物中比较保守，仅个别氨基酸有差异。GLP-2主要由肠道L内分泌细胞合成和分泌，而且受摄食、疾病引起的肠粘膜病例损伤影响。GLP-2只有以完整形式(1-33)存在时才有生物学活性，其在体内的半衰期只有7min，可被DPP4(CD26)通过识别并水解N末端的Ala而成为无活性的GLP-2(3-33)，并经由肾脏排出。

2GLP-2在肠道内的生物学功能

1971年Dowling等报导一位患有胰高血糖素瘤的妇女同时表现出小肠肿大，而肿瘤切除后小肠的异常肿大随之消失。十年之后，第二例胰高血糖素瘤伴有绒毛异常增生的病例才报导出来。据报道肠绒毛异常增生和胰高血糖素瘤的关系可以被CT检测到。这些病例使得人们对于PGDP分泌的增高及其对肠道疾病相关肠损伤的反应产生了浓厚的兴趣。尽管一系列实验证明PG基因和PGDP的分泌升高有关，但PGDP种类较多，具体是哪个特异因子发挥作用一直没有确定。直到有人报道在PGDP中，GLP-2具有促进肠粘膜细胞增殖的作用，对于GLP-2的研究才拉开了序幕。

研究表明外源性GLP-2能促进小肠的生长。在体研究发现，GLP-2可通过增加肠上皮层的细胞数量来显著增加模型动物的肠重量，其机制是GLP-2可刺激肠隐窝上皮细胞增殖并抑制隐窝和绒毛细胞凋亡从而导致隐窝-绒毛高度增高引起的。最终，外源性GLP-2可以增加粘膜的功能表面区域。GLP-2对肠的显著作用在临床试验中也得到了证实。短肠综合症(SBS)的受试者服用六个星期的GLP-2或者三个星期的GLP-2类似物(Teduglutide)(0.03-0.15mg/kg/day)可增加隐窝-绒毛高度和有丝分裂指数并且提高肠内营养的吸收。相似的，给SBS患者服用20-24周的Teduglutide(0.05mg/kg/day)可以减少20-63％的肠道外营养。另一项研究表示通过评估血液中瓜氨酸的浓度，证明Teduglutide(0.05-0.2mg/kg/day)同样可以增加Crohn’s综合症患者的肠粘膜重量和高度。