[发明专利]一种“妃子笑”荔枝品种离体再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及‘妃子笑’荔枝品种离体再生的方法，具体的，本发明涉及‘妃子笑’荔枝品种从愈伤组织诱导经体胚发生途径，发育成完整离体再生植株的培养方法。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是我国南方主要的热带南亚热带果树，在热带农业生产中占有重要地位，是农民收入来源的重要组成部分。随着人们生活水平的日益提高，对商品价值的追求也越来越高，加快荔枝育种技术与新品种培育的需求已迫在眉睫。荔枝童期长，遗传组成高度杂合，传统的育种技术来改良荔枝性状及培育新品种费时、费力、困难大，已经不能满足荔枝产业发展的需要。而分子克隆和转基因技术已经日渐成熟，采用植物转基因技术育种有定向改良、扩展育种范围和缩短育种年限等特点。

自1983年傅莲芳等报道荔枝组织培养获得完整植株以来，研究者陆续进行了组织培养研究，但是，进展比较缓慢。目前荔枝生物技术育种的瓶颈在于未能建立起高效的遗传转化体系，而建立荔枝离体再生体系是高效遗传转化体系建立的前提和基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种妃子笑荔枝品种离体再生的方法。该方法通过优化愈伤组织诱导培养基的组分、体细胞胚诱导的培养基组分，特别是激素的选择和浓度，同时优化了培养条件，获得了很高的愈伤组织诱导率和体细胞胚的诱导效率。

本发明所提供的荔枝妃子笑品种离体再生的方法，包括下述步骤：

1)以荔枝妃子笑品种花药为外植体，将外植体接种于诱导培养基进行愈伤组织诱导培养，筛选得到胚性愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基的基础上添加终浓度为3mg/L的2，4-D、终浓度为0.5mg/L的6-BA、终浓度为0.5mg/L的NAA、终浓度为30g/L的蔗糖的固体培养基或者MS培养基的基础上添加终浓度为1mg/L的2，4-D、终浓度为1mg/L的6-BA、终浓度为1mg/L的NAA、终浓度为30g/L的蔗糖的固体培养基；所述愈伤组织诱导培养基优选为MS培养基的基础上添加终浓度为3mg/L的2，4-D、终浓度为0.5mg/L的6-BA、终浓度为0.5mg/L的NAA、终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为7g/L的琼脂，灭菌后，调节PH值至5.8获得的培养基或者MS培养基的基础上添加终浓度为1mg/L的2，4-D、终浓度为1mg/L的6-BA、终浓度为1mg/L的NAA、终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为7g/L的琼脂，灭菌后，调节PH值至5.8获得的培养基；所述愈伤组织诱导培养的条件是23-27℃暗培养15-30天。

2)对步骤1)获得的愈伤组织进行体细胞胚诱导培养得到体细胞胚；所述体细胞诱导培养的培养基为MS培养基的基础上添加终浓度为5mg/L的KT、终浓度为0.1mg/L的NAA、终浓度为100mg/L的肌醇、终浓度为50g/L的蔗糖的固体培养基或者MS培养基的基础上添加终浓度为5mg/L的ZT、终浓度为0.1mg/L的NAA、终浓度为100mg/L的肌醇、终浓度为50g/L的蔗糖的固体培养基；所述体细胞诱导培养的培养基优选为MS培养基的基础上添加终浓度为5mg/L的KT、终浓度为0.1mg/L的NAA+终浓度为100mg/L的肌醇+终浓度为50g/L的蔗糖和终浓度为10g/L的琼脂，灭菌调节pH至5.8获得的培养基或者即MS培养基的基础上添加终浓度为5mg/L的ZT、终浓度为0.1mg/L的NAA、终浓度为100mg/L的肌醇、终浓度为50g/L的蔗糖和终浓度为10g/L的琼脂；所述体细胞诱导培养的条件是23-27℃暗培养30-45天；

3)对步骤2)获得的体细胞胚进行成熟培养获得成熟的细胞胚；所述成熟培养的培养基为50ml/L的椰乳、终浓度为60g/L的蔗糖的固体培养基；所述成熟培养的培养基优选为50ml/L的椰乳、终浓度为60g/L的蔗糖和终浓度为10g/L琼脂，灭菌，调pH至5.8获得的培养基；所述成熟培养的条件为温度23-27℃，光照培养。椰乳(或者椰汁)为新鲜椰子倒出的经双层纱布过滤后得到的椰子水。

4)对步骤3)获得的成熟的细胞胚进行再生培养，再生培养的培养基为在MS培养基的基础上添加终浓度为30g/L的蔗糖的固体培养基，优选为在MS培养基的基础上添加终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为7g琼脂，灭菌，调pH至5.8获得的培养基；再生培养的培养条件为温度23-27℃，光照培养。