[发明专利]一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法

权利要求书

1.一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）、分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342；

将甘油管保藏的巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株0.5mL接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，即得斜面种子，所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以YPD液体培养基体积1%～5%的接种量接入到YPD液体培养基的中，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时，菌体OD₆₀₀达到3～5，获得摇瓶种子，所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；

2）、一级种子培养：

A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L罐中配制30L的YPD液体培养基，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行降温，当YPD液体培养基温度降至25-35℃时，开始接种；

B、摇瓶种子1000mL从50L发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在28～30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养20～24h后，得一级种子；

3）、二级种子培养：

二级种子培养在5m³发酵罐中进行，二级种子培养基采用BSM液体培养基，步骤如下：5m³发酵罐中装BSM液体培养基体积为3m³；所述的BSM液体培养基为：质量浓度85%磷酸15L/m³，二水硫酸钙0.4Kg/m³，硫酸钾8Kg/m³，七水硫酸镁6Kg/m³，甘油36Kg/m³和微量元素溶液3L/m³加水制成，也就是说BSM液体培养基为质量浓度85%磷酸15L，二水硫酸钙0.4Kg，硫酸钾8Kg，七水硫酸镁6Kg，甘油36Kg和微量元素溶液3L加水至1m³；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜14g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4g/L，二水钼酸钠0.1g/L，硼酸0.1g/L，六水合氯化钴1g/L，氯化锌36g/L、七水合硫酸亚铁65g/L和质量浓度为98%的浓硫酸5mL/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜14g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4g，二水钼酸钠0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化钴1g，氯化锌36g、七水合硫酸亚铁65g和质量浓度为98%的浓硫酸5mL加水至1L；

用2）A步骤中对YPD液体培养基相同的灭菌方法对BSM液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调BSM液体培养基pH值至4.8～5.0，然后将培养好的一级种子30L接种到3m³的BSM液体培养基中，接种量为1%，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过空气压力将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度30～32℃，通风比1：1~1.5vvm，罐压0.05MPa，pH5.0～5.5，培养24~30h，得二级种子；

4）、发酵罐甲醇蛋白生产

发酵培养基为与3）步骤中的二级种子的BSM液体培养基相同的培养基，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3～4m³/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121-125℃，进入在层流罐中维持20min后，进入50m³发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m³发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m³发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m³发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m³发酵罐内的发酵培养基降温到30℃～35℃；用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基至pH5.0，然后将二级种子以发酵培养基体积10%的接种量接种到50m³发酵罐内pH值为5.0的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30～32℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH5.0～5.5，培养16~20h，罐内料液中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD₆₀₀达到36～40，湿重达到100～120g/L，向50m³发酵罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至发酵结束，发酵72～84小时后，取样测定菌体湿重达350～400g/L，发酵结束，得发酵液；

5）、出料

发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到发酵液储罐中，静置，沉降4～8小时，沉降液经卧螺离心机离心，得菌泥，收集到储存罐中，加入菌泥体积1/5的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，喷雾干燥，收集蛋白干粉。

2.根据权利要求1所述的单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、摇瓶种子培养：

将甘油管保藏的巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，即得斜面种子；取1支培养好的斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有250mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24小时后，菌体OD₆₀₀达到3～5，获得摇瓶种子；

2）、一级种子培养：

A、在50L发酵罐中先加水10L，再投入300克酵母提取物、600克胰蛋白胨、600克葡萄糖，搅拌溶解，然后再加水至30L得YPD液体培养基，打开罐体蒸汽阀进口，通蒸汽进发酵罐夹套层，将YPD液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，时间30min，同时，对发酵罐的空气过滤器和取样口灭菌10min，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，同时使冷却水进入罐体夹套对培养基降温，当培养基温度降至30℃时，开始接种；

B、摇瓶种子1000mL从50L发酵罐接种口倒入，接种前检查种子质量，要求无杂菌污染，菌体生长良好，出芽整齐，接种后，控制发酵罐温度30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养24h后，得一级种子；

3）、二级种子培养：

将3m³BSM液体培养基装入5m³发酵罐中，用2）A步骤中对YPD液体培养基相同的灭菌方法对BSM液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调BSM液体培养基pH值至4.8～5.0，然后将30L一级种子通过压力管道接种到5m³发酵罐内pH值为4.8～5.0的BSM液体培养基中，接种时二级种子罐罐压在0.01-0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05-0.1MPa，通过空气压力将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度32℃，通风比1：1~1.5vvm，罐压0.05MPa，pH5.0～5.5，培养30h，得二级种子；

4）、50m³发酵罐中甲醇蛋白的发酵生产

发酵培养基为与3）步骤中的二级种子所用BSM液体培养基相同配方，首先将30m³发酵培养基投入到配料罐内，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为4m³/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到125℃，进入层流罐中维持20min后，进入50m³发酵罐中，当进料完毕后，关闭进料阀，并将50m³发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m³发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m³发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，打开50m³发酵罐内盘管冷却管进水阀门，对发酵培养基降温；待发酵培养基温度降到30℃时，用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基至pH5.0，然后将3m³二级种子接种到50m³发酵罐内的pH值为5.0的30m³发酵培养基中开始发酵，发酵温度30℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH5.0～5.5，培养20h，罐内料液中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD₆₀₀达到40，湿重达到120g/L，向50m³发酵罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，当溶氧上升高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至发酵结束，发酵72小时后，取样测定菌体湿重达392g/L，发酵结束，得发酵液；

5）、出料

发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到两个25m³的发酵液储罐中，静置沉降4～8小时，沉降液经卧螺离心机离心，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，离心获得菌泥，收集到发酵液储存罐中，向发酵液储存罐中加入2m³清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，调节进口温度至130～150℃、出口温度至65-80℃，进料流量为1吨/小时，进行喷雾干燥，收集蛋白干粉。