[发明专利]一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母及其应用

权利要求书

1.一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母，其特征在于，分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342。

2.权利要求1所述的一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下：

（1）、利用巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株生产单细胞蛋白的方法：

一级种子的培养：将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，得斜面种子，取2支培养好的斜面种子，每支用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，分别接种到2个装250mL YPD液体培养基的2L三角瓶中，28-32℃摇床中200-300rpm振荡培养25-35小时，得一级种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量计的1%酵母浸膏、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；

二级种子培养：在50L发酵罐中加入YPD液体培养基30L和二甲基硅油20mL，通入蒸汽对罐内培养基进行灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min，在对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样品也进行灭菌，灭菌结束后，用冷却水进罐体夹套对培养基进行降温，待温度降至30～35℃后，将培养好的500-600mL一级种子全部接入罐内YPD液体培养基中进行培养，培养条件为：培养温度30-32℃，通气量1.5～2vv/m，转速200-300rpm，培养24～30小时后，菌体OD₆₀₀值达到40~45，得二级种子；

（2）、无机盐培养基的制备：

无机盐培养基的配制：先在发酵罐中加入1m³水，然后称取以下各物质并依次加入到发酵罐中搅拌溶解：质量浓度为85%磷酸25kg/m³，磷酸氢二钾0.5kg/m³，氯化铵0.3kg/m³，二水硫酸钙0.2kg/m³，氯化钠0.5kg/m³，硫酸钾3kg/m³，七水硫酸镁2kg/m³，甘油25kg/m³，微量元素溶液4L/m³；所述的微量元素溶液是由五水硫酸铜1.5g/L，碘化钾0.02g/L，一水硫酸锰0.5g/L，二水钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化钴0.3g/L，氯化锌20g/L，七水合硫酸亚铁19g/L，质量浓度为98%的硫酸4mL/L，生物素0.2g/L，对氨基苯甲酸0.05g/L和泛酸钙0.05g/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜1.5g，碘化钾0.02g，一水硫酸锰0.5g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，六水合氯化钴0.3g，氯化锌20g，七水合硫酸亚铁19g，质量浓度为98%的硫酸4mL，生物素0.2g，对氨基苯甲酸0.05g和泛酸钙0.05g加水至1 L；；

（3）、巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中高密度发酵：

巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中采用上述无机盐培养基进行菌体蛋白生产：其中，罐中无机盐培养基装液量为2.5m³，用160℃以上的蒸汽对其进行灭菌，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后用冷却循环水对无机盐培养基进行降温，当罐内无机盐培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5～5.0，然后将二级种子30L全部接种到5m³发酵罐内pH为4.5～5.0的2.5m³无机盐培养基中进行发酵，发酵温度为30～32℃，通气量1.5～2vv/m，搅拌转速80-200rpm，24小时后，无机盐培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升，开始流加甲醇，用甲醇检测仪器在线监测甲醇浓度，甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，每6个小时取样测定菌体OD₆₀₀值和湿重，45-50小时后，菌体湿重达到250-300 g/L，OD₆₀₀值达到42～45，此时发酵结束，收集发酵液；

（4）、将5m³发酵罐中的发酵液在30m³发酵罐中高密度发酵，30m³发酵罐中用的发酵培养基与5m³发酵罐中的发酵培养基相同，均为无机盐培养基，配制方法同步骤（2）：

30m³发酵罐中装无机盐培养基20m³，用同（3）步骤中的灭菌方法灭菌结束后，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5-5.0，将5m³发酵罐中的发酵液在发酵结束前12小时移种1m³到30m³发酵罐内的无机盐培养基中进行发酵，发酵温度30～32℃，控制罐内无机盐培养基中溶氧为30-50%，搅拌转速100-150rpm，当无机盐培养基中甘油消耗完后溶氧快速上升，溶氧达到70%以上时开始流加甲醇，流加甲醇速度为5L/h/m³，当菌体湿重达到125g/L后，甲醇流加速度为12～15L/h/m³，发酵54～60小时后，菌体湿重达到380～450g/L，发酵终止；

（5）、甲醇蛋白提取：

将上述（4）步骤在30m³发酵罐中获得的发酵液经卧式离心机，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，连续离心浓缩获得浓缩的菌体蛋白液，浓缩的菌体蛋白液收集到5m³发酵液储罐中，向储罐中加入1m³的清水，搅拌均匀，经喷雾干燥机进行喷雾干燥，调节进风口温度至140～160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，收集蛋白干粉。

3.根据权利要求2所述的一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下：

（1）、一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母，是分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342；

（2）、利用巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株生产单细胞蛋白的方法：

一级种子的培养：将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株 0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，取2支培养好的斜面种子，每支用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，分别接种到2个装250mL YPD液体培养基的2L三角瓶中，置于30℃，220rpm的摇床中振荡培养约25小时，菌体OD₆₀₀达到3～4，即为一级种子；

二级种子培养：在50L发酵罐中加入30L的YPD液体培养基，20mL二甲基硅油作消泡剂，通入蒸汽对罐内培养基进行灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min，在对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样品也进行灭菌，灭菌结束后，用冷却水进罐体夹套对培养基进行降温，待温度降至30～35℃后，将2瓶共500mL的一级种子接种至发酵罐中的YPD液体培养基中，培养条件为：培养温度32℃，通气量1.5～2vv/m，转速300rpm，培养24~30小时后，菌体湿重达到30~35g/L，OD₆₀₀值达到40~45，得二级种子；

（3）、巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中高密度发酵：

巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中采用无机盐培养基进行菌体蛋白生产：其中，罐中无机盐培养基装液量为2.5m³，用160℃以上的高温蒸汽对其进行灭菌，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后用冷却循环水对无机盐培养基进行降温，当罐内无机盐培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5～5.0，然后将二级种子30L全部接种到5m³发酵罐中进行发酵，发酵温度为30～32℃，通气量1.5～2vv/m，搅拌转速80-200rpm，24小时后，无机盐培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升，开始流加甲醇，用甲醇检测仪器在线监测甲醇浓度，发酵液中甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，每6个小时取样测定菌体OD₆₀₀值和湿重，45-50小时后，菌体湿重达到250-300 g/L，OD₆₀₀值达到42～45，此时发酵结束，收集发酵液；

（4）、将5m³发酵罐中的发酵液在30m³发酵罐中高密度发酵，30m³发酵罐中用的发酵培养基与5m³发酵罐中的发酵培养基相同，均为无机盐培养基，配制方法同上：

30m³发酵罐中装无机盐培养基20m³，用同（3）步骤中的灭菌方法灭菌结束后用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5-5.0，将5m³发酵罐中的发酵液在发酵结束前12小时移种1m³到30m³发酵罐内的无机盐培养基中进行发酵，发酵温度30～32℃，控制罐内培养液溶氧为30-50%，搅拌转速100-150rpm，当无机盐培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，溶氧达到70%以上时开始流加甲醇，流加甲醇速度为5L/h/m³，当菌体湿重达到125g/L后，甲醇流加速度增加到12～15L/h/m³，发酵54～60小时后，菌体湿重达到380～450g/L，镜检观察发现菌体个大，内容物较多，出芽数量较少，发酵终止；

（5）、甲醇蛋白提取：

将上述（4）步骤在30m³发酵罐中获得的发酵液经卧式离心机，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，连续离心浓缩获得浓缩的菌体蛋白液，浓缩的菌体蛋白液收集到5m³发酵液储罐中，向储罐中加入1m³的清水，搅拌均匀，经喷雾干燥机进行喷雾干燥，调节进风口温度至140～160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，收集蛋白干粉，称重，25公斤/袋，包装。