[发明专利]一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法

说明书

技术领域

本发明提供一种检测农药克百威残留的免疫传感器制备方法，属于生物传感器技术领域。

背景技术

近年来，农药残留引起的中毒事件屡屡发生，果蔬中的有害、剧毒农药的残留问题一直是人们关注的焦点，也是现今中国加入WTO后，农产品出口遭遇“绿色壁垒”的主要影响因素之一。克百威是氨基甲酸酯类杀虫剂主要品种之一，它作为一种光谱杀虫剂被广泛应用于当今农业中。该药剂具有内吸性，能通过根、茎、叶或种子吸收传导，并输送到植物体的各器官，也能通过径流渗透污染地下水。研究发现克百威的代谢物可引起细胞强烈的DNA单链断裂，具有明显的细胞毒性。虽然近年来国际上在蔬菜上已禁用该农药，但由于其对某些作物具有生长刺激作用，所以仍有不少违章使用现象。具有这样高毒性的农药残留超标的果蔬流入市场，必将会对人们健康造成严重危害，因此建立一种快速、灵敏、安全可靠的农药残留检测分析方法迫在眉睫。

传统的用于检测克百威残留的分析方法有：气相色谱（GC）、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫(ELISA)等，这些传统的方法虽然具有高选择性和灵敏度，但其受到样品前处理耗时、仪器设备昂贵、操作人员技术要求高、检测时间长等诸多因素的限制，只能局限于实验室操作，不能满足果蔬现场速测的要求。免疫传感器是根据抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理研制成的传感器，与传统的分析方法相比,它具有特异性强、分析速度快、结构简单、成本低廉等优点。而免疫传感器的制备过程中，增大电流的响应、抗原/抗体的固定化并保持其良好的生物活性以及空间排布是制约传感器制备的关键步骤，这些将直接影响免疫传感器的稳定性、重现性、灵敏度和选择性等主要性能。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷、操作简单、灵敏度高，选择性好的检测农药克百威残留的电流型免疫传感器的制备方法。

其技术方案为：一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：电流型免疫传感器的组装过程为自组装4’4-硫代联苯硫酚（DMDPSE）、电沉积纳米金（DpAu），重复第一步和第二步2遍，构建稳定的金硫体系，然后固定克百威单克隆抗体，最后用BSA封闭电流型免疫传感器制备结束，放入冰箱里4℃保存备用。

所述的一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：实验条件的优化，主要包括电沉积纳米金的层数、测试底液的pH以及孵育时间；所制备的电流型免疫传感器的工作曲线为：%ΔI = 16.676 + 8.7332 lgC (ng/mL)；免疫传感器性能检测包括特异性、稳定性、重现性、再生性以及免疫传感器对蔬菜样品回收率的测定。

其制备原理为：本发明采用4’4-硫代联苯硫酚、电沉积纳米金对金电极进行修饰，与传统的方法相比，采用4’4-硫代联苯硫酚两端的巯基以及其刚性结构，巯基一端通过金硫键连接裸金电极，巯基另一端通过金硫键连接电沉积的纳米金，并通过层层自组装的方法，构建了一种具有高稳定性、高度有序的金硫（Au-S）体系。由于纳米金较高的比表面积、稳定性和导电性可以增大电极表面电子的转移和生物相容性，进而增大免疫传感器的响应电流；与传统的滴涂纳米金胶的方法相比，电沉积的纳米金在电极表面具有更好的稳定性、均匀性，并且沉积过程简单、省时、可控。电沉积的纳米金为抗体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，保持了抗体的生物活性以用来和农药有效的特异性结合。通过层层自组装，扩大了电极的有效固定面积，提高了电极表面抗体的有效固定量。将经过上述步骤修饰过的金电极制成免疫传感器后，检测农药克百威的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明制成的电流型免疫传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药克百威残留的快速测定，直接对克百威农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测克百威农药残留的免疫传感器制备方法，其特征在于：⑴配置一系列的克百威标准液，用以得出上述制备的电流型免疫传感器的工作曲线、检测范围和检测限；⑵配置一系列经常混合使用的农药溶液，以检测所制备电流型免疫传感器的选择性；                                                通过循环伏安扫描多段验证上述免疫传感器的稳定性，通过解离抗原抗体免疫复合物和再次免疫检测其再生性能；通过检测实际蔬菜样品得出免疫传感器的加标回收率。