[发明专利]检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及耐药检测方法，特别涉及检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及制备方法。

背景技术

目前，我国幽门螺杆菌感染率超过50％，部分高发地区甚至到达70％-80％。幽门螺杆菌被认为是1类致癌因子，长期幽门螺杆菌感染会导致萎缩性胃炎，肠化生甚至胃癌。随着幽门螺杆菌对抗生素耐药性增加，根除率降低，尤其以常用抗生素克拉霉素为著，因此检测其对克拉霉素的耐药情况尤为重要。

在本发明之前，检测幽门螺杆菌对常用抗生素的耐药情况有E-test法和取胃粘膜提DNA两种方法。E-test法是一种应用于各种细菌耐药性的检测方法，该法用于检测幽门螺杆菌对常用抗生素耐药情况主要是通过取胃粘膜组织后涂菌环涂菌，2-3天后进行液体培养，将培养好的细菌均匀涂在培养皿上，通过加入不同抗生素贴条，根据贴条刻度判断其耐药情况。但该方法操作复杂，且稳定性差，易受外界条件干扰，因此在临床上未得以广泛应用。而胃粘膜提DNA法主要通过取感染者胃组织，试剂盒提取DNA，PCR扩增后酶切，通过电泳条带判断突变位点，进而判断细菌耐药情况。该法同样存在操作复杂，病人痛苦不愿配合等缺点，因此该法也无法在临床中应用。

发明内容

本发明目的就在于克服上述缺陷，研究一种检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及其制备方法。

本发明的技术方案是：

检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒，其主要技术特征在于该试剂盒由提取粪便DNA试剂，PCR反应试剂，PCR产物纯化试剂和纯化产物酶切试剂组成；具体在于：

(1)其中所述的提取粪便DNA试剂包括2×十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2％巯基乙醇，PBS缓冲液；

(2)其中所述的PCR反应试剂包括引物1，引物2，引物3，引物4，Taq Premix(2×)；

(3)其中所述的PCR产物纯化试剂包括4mol/L醋酸铵；

(4)其中所述的纯化产物酶切试剂：酶1，酶2。

本发明的另一技术方案是：

检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒操作方法，其主要技术特征在于试剂盒的操作方法包括以下步骤：

(1)粪便DNA提取：取适量新鲜粪便，经过预处理后，向所得沉淀加入DNA提取试剂，经过离心，提上清等一系列步骤，可获得DNA产物；

(2)PCR反应：向离心管中加入上述提取的DNA、引物1、引物2、Taq Premix(2×)和ddH₂O，进行两次PCR反应，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带可判断有无幽门螺杆菌感染；

(3)PCR产物纯化：吸取PCR产物置于EP管中，加入等体积醋酸铵、异丙醇溶液后，振荡混匀，经3次乙醇漂洗、离心等步骤后将所得终产物室温下干燥，加20ulddH₂O，置4℃冰箱备用；

(4)纯化产物酶切：向纯化产物中加入酶1，酶2，酶切后取5ul产物琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带可判断有无克拉霉素耐药存在。

本发明的又一技术方案是：

检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒制备方法，其主要技术步骤在于：

制备DNA提取试剂：

(1)制备无菌PBS缓冲液：将4gNaCl，0.1gKCl，1.7g Na₂HPO₄.12H₂O，0.1g KH₂PO₄加入400ml ddH₂O中，调节Ph至7.4后用ddH₂O定容至500ml，分装成100ml后置入试剂盒；

(2)制备2×CTAB提取液，其PH 8.0：由2％ CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl，0.2％巯基乙醇组成，即称取CTAB 2g加ddH₂O40ml，加1MTris-cl10ml，PH8.0，0.5M EDTA4ml，PH 8.0和5M NaCl 28ml，待CTAB溶解后用ddH₂O定容到100ml，提取前加入2％的巯基乙醇，即100ml加0.2ml巯基乙醇；

(3)制备1M Tris-cl 100ml：在80ml ddH20中加入12.11g Tris碱和4.9mlHCl，三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至100ml；