[发明专利]黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

14-3-3最先在人脑中发现，其蛋白家族广泛存在于真核生物中，序列高度保守，单体分子量27-32kD，通过与靶蛋白上的ser/thr残基结合来发挥调控功能。

在植物中的14-3-3蛋白主要分为ε组和非ε组两组。不同的同工型在核心区域显示出高度保守的氨基酸序列。

14-3-3蛋白能够以多种机制与靶蛋白相互作用，对各种不同细胞功能和生理过程起调控作用。Testerink C等在大麦胚芽中发现14-3-3蛋白的各种同工型在大麦萌发过程中表达调控机制不同，其功能也明显不同。在之后的研究中，许多研究表明，14-3-3蛋白还与信号转导、碳氮代谢的调控、叶绿体前前体蛋白的调节、SPS以及PM H+-ATPase活性调节有关。14-3-3蛋白还参与植物病害和胁迫反应应答，Finnie等发现大麦抵御灰霉病的过程中积累14-3-3蛋白；Roberts M R和Bowles D J发现番茄中14-3-3蛋白在对受伤和病原菌侵染的应答中起作用；拟南芥14-3-3蛋白的GF14λ同工型可与APX3和AKR2等相互作用，在植株抗氧化和抗干旱中起重要作用。

许多研究表明，在植物中其对代谢活动的主要酶类如NR、SPS、PM H+-ATPase活性有调控作用。最新研究表明，由14-3-3蛋白调控的植物细胞功能涉及生物合成代谢酶、囊泡穿梭、细胞周期、细胞凋亡以及细胞信号转导等多个方面。

大豆有17种14-3-3蛋白，14-3-3j在叶片中累积量多，且与叶片的气孔开闭、H+-ATPase磷酸化及活性等相关性强。

综述，14-3-3j与GST标签的融合蛋白的报道较少，且这个融合蛋白表达鉴定简单的特性给研究14-3-3j的功能能促进植物抗性研究，进一步深入研究植物环境胁迫应答提供可行性基础。

发明内容

本发明的目的在于提供黑大豆14-3-3j的原核表达载体，一种能产生14-3-3j蛋白的含黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，14-3-3j蛋白基因来源于黑大豆，其GenBank登录号为AK285891，14-3-3j基因的上游是诱导型lac启动子。

本发明的另一目的是提供14-3-3j蛋白基因原核表达载体的构建表达方法，具体步骤如下：

（1）根据GenBank上发表的大豆14-3-3j基因EST全长基因序列，设计如下特异性引物：

14-3-3j 5’： GAATTCATGGCAGGAGCAGAGGGGCTAAAC

14-3-3j 3’： CTCGAGTCAGGGCTCATCTAGCTGGTC

引物14-3-3j5’含有限制性内切酶EcoRI识别位点，14-3-3j3’ 含有限制性内切酶XhoI识别位点；

（2）从黑大豆叶片中提取RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以黑大豆叶片cDNA为模板，采用步骤（1）中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对14-3-3j基因的cDNA进行扩增，回收纯化14-3-3j基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，通过PCR检测和酶切检测获得重组载体pMD18-14-3-3j；

（3）使用EcoRI和XhoI对质粒pMD18-14-3-3j进行双酶切获得14-3-3j基因，将14-3-3j基因与同样经过双酶切的原核表达载体相连接，转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得原核重组表达载体；

（4）将重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，形成重组工程菌，重组工程菌经过发酵培养，IPTG诱导表达14-3-3j蛋白。

本发明方法中所述的起始原核表达载体为PGEX-4t-1。

本发明方法中所述的14-3-3j基因插入位点在起始原核表达载体的MCS位点。

本发明方法中所述的重组工程菌在28℃、1mM IPTG条件下诱导表达14-3-3j蛋白。

本发明所述原核表达载体在制备多克隆抗体中的应用，制作的多克隆抗体可以用于检测14-3-3j蛋白表达量和蛋白相互作用的体外验证。