[发明专利]一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法。

背景技术

大鲵(Andrias davidianus)俗称娃娃鱼，属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科、大鲵属，1988年被列为国家二级保护动物，2007年《濒危野生动植物物种国际贸易公约》（CITEJ）第14届缔约国大会被列为Ⅰ类濒危物种。大鲵不仅具有一定的药用和科研价值，而且还可以作为观赏动物和食用佳肴。20世纪80年代以来，我国各地陆续进行了大鲵的人工养殖和繁殖，目前已成为水产养殖中高效养殖的优良品种之一。然而随着养殖规模的扩大，大鲵病害问题日益突出，尤其是近年来暴发的大鲵病毒性出血病，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失，严重制约了其健康养殖的发展。

为了及早发现和确诊大鲵病毒性出血病病原，大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus，GSIV)，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为大鲵养殖业的健康发展提供技术保障。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的GSIV毒株的MCP基因编码区序列(JN615141.1)，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在线软件设计特异性引物，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对大鲵虹彩病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的GSIV，能检测GSIV感染的病鱼组织，能检测GSIV感染的细胞（例如EPC细胞），非常适用于GSIV的现场快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：10×ThermoPol Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl₂，1000×SYBR Green I（Invitrogen）。

F3：5，-CGACTTGGCCACTTATGACA-3，；

B3：5，-TTGACCTCGGGGGTCTTG-3，；

FIP：5，-GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT-3，；

BIP：5，-AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT-3，。

一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，其步骤是：

1、病毒DNA的获取：

采用试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA。

2、LAMP扩增：

采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂2-10mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，余量去离子水补足。选择55-65℃的温度范围和30－120分钟的时间范围进行LAMP反应之后，80℃灭活2分钟。

3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定：

1）发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。