[发明专利]用于确定血清中游离铜的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于确定血清中的‘游离’铜(血清铜的一部分在结构上不会结合到血浆铜蓝蛋白，最近还称作‘不稳定的’铜)的新的方法，特别地，涉及用于以高度的灵敏度和准确度确定患有阿尔茨海默病的患者的血清样本中的游离铜的方法。本发明还涉及一种用于确定血清中的游离铜的试剂盒，所述试剂盒包括过滤装置和香豆素荧光探针。

背景技术

在大量的疾病(例如阿尔茨海默病(AD))中确定血清铜是首要的。阿尔茨海默病是以记忆丧失和进行性痴呆为特征的神经障碍。晚期的疾病发作形式是散发性的并且具有复杂的疾病病原学，伴随作为最广泛公认为危险因素的亲近和年龄。疾病的原因似乎与β-淀粉样蛋白(Aβ)肽和神经原纤维缠结中的tau蛋白质类在大脑中的聚集紧密有关。此外，载脂蛋白E(APOE)基因的ε4等位基因已被证实为增加阿尔茨海默病风险并且降低发病年龄，尽管它仅占阿尔茨海默病遗传率(留下若干待鉴定的基因危害因素)的百分比的比例。主张为最普及的阿尔茨海默病假说的‘淀粉样蛋白级联’现在已经被采取多种形式作为新的关于疾病形成的内容。实际上，已经假设了多样的发病机制的途径以贡献于阿尔茨海默病发作和进展。例如，在涉及需要被作为靶子的疾病级联的致病途径中已经指出除了Aβ低聚物和有毒的tau聚集物之外，还包括氧化性损伤、异常的炎症或能量代谢受损。有主要通过金属氧化还原反应的氧化性应激导致阿尔茨海默病大脑的损伤的充足的证据。尤其，已经提出了Aβ肽的高的金属化可以是氧化性应激的氧化还原循环的基础，并形成H₂O₂产物、Aβ低聚体和沉淀物。产生不稳定的铜流动库的金属体内稳态的扰乱可供给大脑铜储源，大脑铜储源能够参加Aβ-氧化性应激循环，对阿尔茨海默病级联产生多效性。这种看法现在由说明铜在阿尔茨海默病中稍微而显著地增加，在没有结合到血浆铜蓝蛋白的铜(还称作‘游离’铜)的血清库中的具体且相对高的增加与阿尔茨海默病的典型的征兆和脑脊髓液标记物相关的多个证据来支持，并且已经在诉说非常轻度认知损伤的受试者中是明显的。虽然铜功能障碍不能够被臆断为作为疾病的唯一决定因素，但能够主张作为对于阿尔茨海默病的重要危险因素作用的它的决定性(而不是相关)作用，因为它似乎由实际临床证据、流行病学证据、实验性证据、荟萃分析(meta-analysis)证据和遗传学证据来支持。

在血液中血浆铜蓝蛋白是主要的铜运载蛋白质，在血清中血浆铜蓝蛋白是主要亚铁氧化酶蛋白质，并且血浆铜蓝蛋白在结构上结合6个铜原子，形成活性整体-蛋白质的形式，活性血浆铜蓝蛋白占循环铜的85-95％的比例，剩余的是游离铜。实际上，在先前的研究中，发明人过去曾经起始于铜和血浆铜蓝蛋白的测量来判断游离铜，伴随的计算如下：血清铜浓度通过用通过使用装备有具有平台HGA 800的石墨炉的A Aanalyst 300Perkin Elmer原子吸收分光光度计的原子吸收光谱技术或根据Abe等Clin Chem 1989(Randox Laboratories，Crumlin，UK)的比色法中的一个测量它们来双重检查；血浆铜蓝蛋白是通过根据Wolf Pl Crit Rev Clin Lab Sci 1982的免疫比浊法试验(Horiba ABX，Montpellier，France)来分析的，对于每个血清铜和血浆铜蓝蛋白对，按照公开在Walsh等Ann Clin Biochem 2003的标准程序，计算结合到血浆铜蓝蛋白(CB)的铜的量和未结合到血浆铜蓝蛋白的铜(‘游离’铜)的量。该计算以μmol/L表达‘游离’铜，并且基于血浆铜蓝蛋白含有0.3％铜的证据。

此外，最近发明人根据先前的方法建立了自动化程序以测量血浆铜蓝蛋白氧化酶活性，其利用邻联茴香胺二氢氯化物作为底物。实际上，众所周知，通过免疫学方法(如在我们先前的研究中示出的)获得的血浆铜蓝蛋白的值比那些采用酶(即监控蛋白质的氧化酶活性)获得的值更高。这是因为脱辅基形式的浆铜蓝蛋白在生物学上不活泼。因此，来自以上报道的方法和计算的游离铜的值被过低估计。

然而，由于它的成本、商业上可利用的血浆铜蓝蛋白的可变的纯度以及在国际单位中(UI)对报道血清酶的广泛的推荐，通过基于标准血浆铜蓝蛋白溶液的酶方法的血浆铜蓝蛋白的定量还未被认为是本领域的现有技术。先前，发明人尝试用商业标准(人类血清血浆铜蓝蛋白，Sigma-Aldrich)从蛋白质的氧化酶活性开始定量化血浆铜蓝蛋白的量，但是后者的分光镜检查显示在逐日试验中的吸收的蛋白质峰值的衰退，降低了在使用酶的探测定量化蛋白质的量中的置信度，且需要估计游离铜值。