[发明专利]开发病原体‑响应嵌合启动子的新型植物来源顺式‑调节元件

说明书

技术领域

本发明涉及一种顺式-调节元件和由该顺式-调节元件生成的具有病原体或者诱导子诱导植物活性的嵌合启动子。此外，上述发明涉及一种宿主细胞、一种转基因植物细胞、一种转基因植物组织以及一种转基因植物和其种子。此外，上述发明还涉及一种用于生成转基因植物，尤其是抗病原体植物的方法。

背景技术

由于真菌、病毒、线虫和细菌导致的植物疾病导致全球大量的作物减产，影响了农产品质量，因此需要大量使用化学杀虫剂，因为植物的自然防御措施(借助该自然防御措施可以防御大量的潜在病原体或者延迟和限制其扩散)通常不足以抵抗病虫害。可以使用基因技术方案创造可抵抗上述病原体的植物。通过在感染点(病原体和植物之间的接触点)有针对性地形成可触发植物较强耐抗反应的蛋白(作用剂)表达或者可自行毒杀病原体或者可抑制病毒生长的分子表达使得植物具有较高的奶抗性。

可触发植物较强耐抗反应的作用剂包括诸如自动活性耐抗基因(R-基因)或者可激活植物内源耐抗基因的非病原性基因蛋白。较强的耐抗反应包括超敏反应(HR)、宿主组织在感染位置的控制性细胞死亡、通过木化作用和形成角质增强植物的细胞壁，形成植物抗毒素和产生PR(病原体相关的)蛋白。

因为该耐抗反应具有较高的能量需求，且可能导致植物细胞死亡(坏死)，因此其触发过程必须进行严格的控制。相同的情况也适用于病原体毒性蛋白或者肽的表达，只要该蛋白或者肽的基本表达对植物或者其农业特性(例如产量)具有不利作用。在一种转基因方案中，可以通过使用具有期望特性的启动子进行控制。

通过使用各种已知的自然病原体诱导启动子，例如PR1-启动子，可以实现转基因(如作用剂)的病原体诱导表达(Rushton等，1996)。尤其是，微阵列技术的发展使得已经可以对大量的病原体诱导启动子进行识别(WO 03/00898，WO 02/50293或者JP 2003284566)。

这一类的自然病原体诱导启动子可能会显示出非特定活性，因为其需要通过大量不同的刺激才可以激活。其原因在于，启动子的分子结构由多种不同的顺式-调节元件组成，存在巨大差异的信号整合于一个复杂的表达方案中。由此，自然病原体诱导启动子也表现出不需要的活性(例如在特定的组织中)或者表现为较高的背景活性。

例如小麦中的抵抗素病原体诱导启动子在种子形成和种子萌芽过程中活动(Kovalchuk等，2010)。上述PR1-启动子不仅通过病原体，而且也通过衰老进行诱导(Morris等，2000)

在其他试验中显示，自然的、因锈病诱发的亚麻Fis1启动子在转化后不适合对亚麻中L6抗锈基因自动活性形式的表达进行针对性调节，并使得除了抗锈性能外不会出现负面的农业特性，例如产量低下(Howles等，2005)。

一种提高启动子最需要特性的可能性是识别负责顺式-调节元件所需的诱导以及由顺式-调节元件组成的嵌合启动子的结构(Venter，2007)。其他刺激的序列基序被去除。

对多种病原体诱导基因的启动子进行了更详细的试验，其中，对促成病原体专有诱导的多种顺式-调节元件进行了识别(Strittmatter等，1996；Eulgem等，2000；Kirsch等，2000，2001；Himmelbach等，2010)。其他示例为通过分步突变自然病原体-诱导启动子识别的顺式-调节元件D-Box，S-Box或者W-Box(WO00/29592)或者接头分区区域LS10或者LS7(Lebel等，1998)。尤其是W-Box试验情况良好，可以利用其核心序列TTGAC(C/T)对W-Box在自然病原体诱导启动子中的附加变体进行查找。

此外，可以借助程序，例如MEME(Bailey和Elkan，1994；Humphry等，2010)或者BEST(Che等，2005)利用生物信息方法对新型顺式-调节元件进行识别。该方法的优点在于，顺式-调节元件不再识别为较短的单独序列，而是识别为经确定以的序列基序，通过该序列基序可以对多个顺式-调节元件变体，即多个转录因子连接位置的变体进行确定。当然，这一类的生物信息方案也经常用于测定假阳性序列，从而使得仅对潜在序列或者序列基序进行预先选择。但通常必须强制证明和检验顺式-调节元件的功能，并专门对促进病原体诱导的顺式-调节元件的功能进行检验和证明。此外，这一类的实验室分析通常花费不菲。