[发明专利]革兰氏阴性菌中负责对碳青霉烯高水平抗性的KPC基因的扩增和检测的分子测定

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发明背景

发明领域

本文公开的实施方式涉及分子诊断学领域，特别地，检测抗生素抗性微生物的诊断测定。

相关技术的描述

抗生素抗性病原体已成为临床环境中渐增的问题。β-内酰胺是一类抗生素，其包括青霉素、头孢烯、单酰胺菌素和碳青霉烯。碳青霉烯显示广谱抗菌活性和共享图1所示的共同的骨架结构，这使得它们高度抵抗β-内酰胺酶。像这样，存在对已获得对碳青霉烯抗性机制的细菌强的选择压力。(Rasmussen et al.，(1997)Antimicrob.Agents Chemother.41：223-232)。

碳青霉烯抗性已知由不同机制引起。在一些情况中，碳青霉烯抗性由细菌孔蛋白基因突变引起，其改变膜通透性。在其它情况中，碳青霉烯抗性可由编码碳青霉烯酶的碳青霉烯活动基因成分的获得而引起。碳青霉烯酶是水解碳青霉烯的β-内酰胺酶。具有碳青霉烯酶的隔离群和具有孔蛋白突变的隔离群的易感性模式可能相同，因此使其不可能利用常规的抗生素易感性测定来区分。

如所提到的，碳青霉烯抗性的一个机制是丝氨酸碳青霉烯酶，KPC——也称作bla_KPC——的产生。KPC最初在2001在肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株中检测和鉴定到。Yigit et al.，(2001)Antimicrob.Ag.Chemother.45(4)：1151-1161描述来自1996年在医院环境中分离的肺炎克雷伯菌菌株1534的KPC-1基因的克隆和序列。肺炎克雷伯菌是多种病状，如肠感染、泌尿道感染、创伤或手术部位感染、肺炎和血液感染的致病因子。肺炎克雷伯菌还牵涉医院获得性感染(HAI)。

在2001年来自肺炎克雷伯菌的KPC-1的最初描述之后，克雷伯菌属中碳青霉烯抗性已迅速增加。KPC酶已在美国东北/中大西洋地区成为地方性的，肺炎克雷伯菌隔离群中碳青霉烯抗性的纽约市地区中医院的监测培养物报告率达24％。参见，Woodford et al.(2004)Antimicrob.Agents Chemother.48：4793-4799。因此，产生碳青霉烯酶的生物体的检测和监视已成为对适当的治疗方案的选择和感染控制措施的执行的重要事情。参见，Yigit，et al.(2001)Antimicrob.Agents Chemother.45：1151-1161。产生bla_KPC的细菌通常对实际上所有种类的抗生素——β-内酰胺剂，包括青霉素、头孢烯、单酰胺菌素和碳青霉烯——有抗性，留给医师对于治疗感染的患者有限的抗生素选择。

除了肺炎克雷伯菌菌株中碳青霉烯抗性的迅速传播，自从1996年，kpc基因已在其它临床相关的肠杆菌科种类——包括奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)、肠沙门菌(Salmonella enterica)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、和弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii)——中，以及在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中被分离和鉴定。含有kpc的微生物中的许多通常在人和其它动物的肠内菌丛、以及水或土壤中发现。参见，Manual of Microbiology，，8^th edition，Ed.P.R.Murray，et al.，ASM Press，Washington，D.C.，2003。编码bla_KPC酶的基因两侧通常是转座子相关的序列，其已在可转移的质粒上鉴定，因此赋予它们在临床环境中迅速传播的潜能。