[发明专利]构建体

说明书

发明领域

本发明涉及一种包含编码参与多巴胺合成途径的酶活性的核苷酸序列的构建体。可操作地连接至少两条核苷酸序列使得它们编码一种融合蛋白。本发明也提供包含所述核苷酸序列的病毒载体基因组、载体生产系统和病毒载体颗粒。核苷酸序列在体内的表达，例如通过使用病毒载体颗粒的基因治疗，导致多巴胺的合成，这在治疗和/或预防以产生多巴胺的神经元的减少或损失为特征的神经系统疾病，如帕金森氏(Parkinson’s disease)病中是有用的。

发明背景

帕金森氏病(PD)是一种神经变性疾病，其是以黑质区产多巴胺的神经元的损失为特征的。这最终导致在纹状体中多巴胺的耗竭，引起严重的运动障碍。帕金森氏病的一种治疗方法是口服给药L-DOPA，即多巴胺的前体，这可以恢复一定程度的运动功能。然而，随着病情的发展，在运动障碍的治疗中L-DOPA治疗变得不那么有效，需要使用更高的剂量，这具有严重的副作用。

可以通过将多巴胺直接释放到纹状体来实现PD的改善治疗。这可以通过基因治疗来实现。基因治疗对于PD治疗是有吸引力的，因为特定蛋白质的产生可以靶向CNS(中枢神经系统)的特定区域，如纹状体。从氨基酸酪氨酸的多巴胺合成涉及酶酪氨酸羟化酶(TH)，其催化从酪氨酸的L-DOPA合成，和芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)，其将L-DOPA转化为多巴胺。TH步骤被认为是限速的。TH发挥功能需要辅因子四氢生物蝶呤(BH4)，其合成是由酶GTP-环化水解酶1(CH-1)催化的。

在PD动物模型中，已经研究了使用腺伴随病毒(AAV)载体从多巴胺生物合成途径递送单一基因的基因治疗方法具有一些行为益处(Leff等人，1999Neuroscience92，185-196；Bankiewicz等人，2006Mol Ther14，564-570)。进一步的方法表明，在PD动物模型中同时递送两种或更多种介导多巴胺合成的酶表现出更大的功效(Fan等人，1998Hum Gene Ther9，2527-2535.；Shen等人，2000Hum Gene Ther11，1509-1519.；Muramatsu等人，2002Hum Gene Ther13，345-354)。

这导致了以下理论，如果所有三种多巴胺合成酶共同并在同一细胞中表达，那么多巴胺合成会更高，并会导致在PD中更有效。然而，由于AAV载体有限的包装能力，可以被递送的基因数量是有限的。因此，决定使用慢病毒载体(LV)用于此目的，因为这些载体的包装容量要大得多。因为它们稳定转导非分裂细胞类型，例如神经元的能力，慢病毒载体(LV)用于对中枢神经系统(CNS)的基因治疗方法是特别有利的。已经开发了衍生自非灵长类慢病毒的，尚未知道对于人类是感染性或病原性的LV，如马传染性贫血病毒(EIAV)，而且确定了其转导非分裂细胞的能力。是一种用于PD治疗的基于马传染性贫血病毒(EIAV)的LV。的基因组是三顺反子构建体，其包含由两个内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接的三种关键的多巴胺合成酶，即TH、AADC和CH1的编码序列。目前正在I/II期临床试验中进行评估，其中使用在包括三种质粒瞬时共转染HEK293T细胞的流程中产生的载体材料(Mitrophanous等人，1999Gene Ther6，1808-1818)。

任何基因治疗方法的一个目标是提高载体的滴度，从而能使用体积更小的载体制备物。这在型治疗中是特别理想的结果，其中将所述载体直接注射到脑中，因此需要使用小体积。

IRES元件的复杂二级结构可能成为有效逆转录的阻碍。因此，本发明人假设IRES元件的去除应该增加载体的滴度。其中一个方案是以编码短肽序列(接头)的序列取代IRES元件以产生包含多巴胺合成所需的三种酶活性中的两种或更多种的融合蛋白。然而，因为TH的天然形式以同源四聚体存在(Goodwill等人，1997Nat Struct Biol4，578-585)，而CH1的天然形式以同源十聚体存在(Nar等人，1995Structure3，459-466；Steinmetz等人，1998J Mol Biol279，189-199)，这些酶彼此或与其它酶，如AADC的融合可能阻止了酶的正确的三级结构形成，然后这可能抑制酶的功能或阻止其以最大的能力发挥功能。支持这一点，先前已经报道，TH和β-半乳糖苷酶之间的融合是无酶活性的(Wu和Cepko(1994)，J Neurochem62:863-72)。