[发明专利]普通烟草中产生的包含血凝素的流感病毒样颗粒(VLP)

权利要求书

1.一种产生病毒样颗粒即VLP的方法，所述VLP展示一种或多种流感抗原，其中当通过分级确定时，所述VLP具有直径在40nm和200nm之间，峰值在90nm和120nm之间的平均粒度分布，所述方法包括步骤：

i.选择普通烟草植物的品种、育种系或栽培品种和农杆菌物种菌株的组合，其中所述品种、育种系或栽培品种在所述品种、育种系或栽培品种的叶已经通过注射器用细胞密度OD₆₀₀为0.32的农杆菌菌株注射5日后显示出少于10％坏死、少于5％坏死、少于2％坏死、少于1％坏死；

ii.用OD₆₀₀在0.1和4.0之间的包含双元载体的(i)中选择的农杆菌物种菌株的悬液浸润(i)中选择的普通烟草植物的品种、育种系或栽培品种的完整植株，所述双元载体包含一种或多种流感抗原的编码序列，所述编码序列处于普通烟草植物中有功能的调节元件控制下；

iii.将浸润的植株在允许可表达核苷酸序列在浸润的植株中表达和异源多肽积累的条件下孵育5日至20日的时间。

2.如权利要求1中所述的方法，还包括步骤：(i)纯化/净化和(ii)捕获VLP。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述双元载体是最小尺寸的双元载体，所述双元载体包含对于质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)和农杆菌(Agrobacterium)细胞中维持和复制及转移T-DNA至烟草植物细胞必需的序列元件并且还包含T-DNA区域，并且其中必需序列元件占据整个最小尺寸双元载体的至少60％、65％、70％、75％、80％。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中流感抗原是流感血凝素或其免疫原性片段。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述双元载体包含植物选择标记基因。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将浸润的植株温育7日和15日的时间。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将浸润的植株温育在8日和10日之间的时间。

8.VLP的组合物，其包含展示一种或多种流感抗原的VLP，其中所述VLP通过权利要求1-7中任一项的方法产生并当通过分级确定时，具有直径在40nm和200nm之间，峰值在90nm和120nm之间的平均粒度分布，并且其中通过LC-APPCI-MS/MS测定时，VLP的脂质双层具有>1的胆固醇:谷固醇比率。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中VLP的脂质双层具有以下含量

a.小于0.5μg/mL的油酸；和/或

b.浓度在3.0μg/mL和5.0μg/mL之间的亚油酸和/或亚麻酸；和/或

c.大于0.75μg/mL的花生酸。

10.根据权利要求8-9中任一项所述的组合物，其中VLP显示出在0.30和0.45之间的脂肪酸和固醇与蛋白质的质量比。

11.根据权利要求8-9中任一项所述的组合物，其中展示在VLP上的抗原是血凝素。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中血凝素是流感A型血凝素或流感B型血凝素。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中流感亚型A血凝素选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中流感亚型A血凝素是H5亚型血凝素。