[发明专利]使用端点PCR确定芸苔中FAD-2基因的接合性的方法

权利要求书

1.一种用于确定包含fad-2基因的芸苔植物的接合性的方法，所述方法包括：

自所述芸苔植物获得基因组DNA样品；

通过使所述基因组DNA样品与第一引物和第二引物接触而产生接触样品，其中所述第一引物优先结合在感兴趣的单核苷酸多态性位置上游的所述fad-2基因的区域，所述第二引物优先结合在感兴趣的单核苷酸多态性位置下游的所述fad-2基因的区域，其中所述第一引物和所述第二引物在进行聚合酶链式反应(PCR)条件处理时生成扩增子；

使所述接触样品进行PCR条件处理，其中产生所述扩增子；

容许第一荧光探针和第二荧光探针中每种于50-70摄氏度的温度与所述扩增子杂交一段时间，所述第一荧光探针在所述感兴趣的单核苷酸多态性不存在于所述扩增子中时优先与所述扩增子杂交，所述第二荧光探针在所述感兴趣的单核苷酸多态性存在于所述扩增子中时优先与所述扩增子结合；

在所述容许步骤中规定的时间段后提高所述温度；

在提高步骤期间捕捉由所述第一和第二探针中每种产生的所述荧光；并

确定所述芸苔植物的接合性，确定步骤包括比较由所述第一和第二探针中每种产生的所述荧光，其中主要反映纯合SNP阳性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述感兴趣的单核苷酸多态性的存在，主要反映纯合SNP阴性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述感兴趣的单核苷酸多态性的存在的缺乏，且主要反映杂合SNP阳性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述芸苔植物包含包括所述感兴趣的单核苷酸多态性的第一等位基因和缺乏所述感兴趣的单核苷酸多态性的第二等位基因。

2.权利要求1的方法，其中所述扩增子由91个碱基对组成。

3.权利要求1的方法，其中所述单核苷酸多态性由C至T多态性组成。

4.权利要求3的方法，其中所述野生型序列包含所述位置处的胞嘧啶。

5.权利要求1的方法，其中所述方法用于杂交育种芸苔植物的育种渐渗确认(breeding introgression verification)。

6.权利要求1的方法，其中所述引物包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，且所述第一和第二探针包含SEQ ID NO:5和4。

7.权利要求1的方法，其中用荧光染料和淬灭剂(quencher)两者标记所述第一和第二探针。

8.权利要求7的方法，其中所述第一探针包含在所述第一探针5’端作为所述荧光染料的FAM和在所述第一探针3’端的MGB淬灭剂。

9.权利要求7的方法，其中所述第二探针在所述第二探针的5’端用VIC标记且在所述第二探针的3’端用MGB淬灭剂标记。

10.权利要求1的方法，其中所述第二探针包含SEQ ID NO:4。

11.权利要求1的方法，其中在读板仪中直接读出所述方法的荧光结果。

12.权利要求1的方法，其中从田间的芸苔植物获得所述DNA样品。

13.权利要求1的方法，其中所述提高步骤包括以每个时间段基本上一致的温度增量提高所述温度。

14.权利要求1的方法，其中在所述提高步骤的每个增量期间在所述捕捉步骤中捕捉所述提高步骤期间由所述第一和第二探针中每种产生的所述荧光。

15.一种用于实施权利要求1的方法的试剂盒，所述试剂盒包含所述第一引物、所述第二引物、所述第一探针、和所述第二探针。

16.权利要求15的试剂盒，其中所述第一引物由SEQ ID NO:2组成，所述第二引物由SEQ ID NO:3组成，所述第一探针由SEQ ID NO:5组成，且所述第二探针由SEQ ID NO:4组成。