[发明专利]用于合成脂肪酸的细菌和方法

说明书

在先相关申请

本申请要求2011年10月17日提交的61/548,005和2011年10月18日提交的61/548,399的优先权，各自通过引用以整体并入。

联邦资助的研究声明

本发明根据由国家科学基金会授予的拨款号：EEC-0813570在政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及通过使用基因工程微生物增加脂肪酸的生产的方法。

背景技术

日益增加的能源成本和环境问题都已强调对于生产可持续的、可再生的燃料和化学品的需求。脂肪酸由长的烷基链组成并且代表自然界的“石油”，作为被细胞使用的初级代谢产物用于化学和能量存储功能。这些高能分子现今从植物和动物油分离，用于从燃料到油脂化学品的多样化的产品。

鉴于用于生产乙醇和相关醇生物燃料的微生物发酵工艺已经非常成熟，生物柴油(脂肪酸的甲基酯)为生物学生产的主要的长链产物，并且现今它几乎全部来源于植物油。然而，工程油籽代谢的缓慢的循环时间和作为副产品的甘油的过度累积为从植物获得生物柴油的两个主要缺点。尽管大多数细菌产生脂肪酸作为细胞被膜前体，但是脂肪酸的生物合成在多个层次被严密地调节并且并不生产较大的量。因此，从细菌生产脂肪酸还没有达到符合成本效益的地步。

通过代谢工程菌株以高产量和高速率生产游离脂肪酸的能力将提供生物学或化学生产较大类的其它衍生产物(化学品和生物燃料)的有效框架。例如，如图1中所示，通过引入额外的适当途径，脂肪酸可被转化为化学品比如烃类、脂肪醇、羟基脂肪酸、二羧酸等。同样地，分子的ω端可在脂肪酸生物合成途径的初始步骤中通过改变起始前体而被修饰(由白色块箭头标记)。此外，这些分子的链长度可通过使用对特定链长度比如C8、C10、C12或C14特异的适当的酰基-ACP硫酯酶而改变。另外，也可在脂肪酸延伸循环期间的不同时间点挖掘出各种分子。

US7759094公开了用于通过基因工程微生物的发酵生产L-氨基酸的方法，其中fadR被过表达并且sucC也被过表达。然而，在该专利中没有关于脂肪酸生产的教导。

US7553645公开了用于使用基因工程或转化的微生物制备L-氨基酸的工艺，其中sucC被过表达。然而，在该专利中没有关于脂肪酸生产的教导。

US7211415也公开了用于通过肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族的基因工程微生物的发酵生产L-氨基酸的工艺，其中sucC被过表达。然而，在该专利中没有关于脂肪酸生产的教导。

US20110195505公开了用于丁醇生产的基因工程乳酸菌，其中在fabZl的缺失导致整个细胞膜饱和脂肪酸的10％的增加。然而，没有关于fabZ过表达对脂肪酸生产的影响的教导。

US20080160585和US20080038787公开了增加从微生物生产赖氨酸的方法，其中sucC调节失控(deregulated)。然而，对于所涉及的调节失控的程度，比如过表达、减少或失活没有公开细节，也没有关于如何达到所述调节失控。

US20060046288公开了具有增加的琥珀酸生产的突变的大肠杆菌(E.coli)菌株，其中fadR基因活性降低。然而，没有具体公开关于所述fadR基因或其调节/突变的细节。

WO2011116279公开了杂合的ACP硫酯酶，其可与天然的fadD和sucC缺失组合。它们还教导了使培养基酸化以增加脂肪酸的生产。

因此，在本领域中存在对于比迄今所能实现的更有效且更具成本效益的生产脂肪酸的生物系统的需要。

发明内容

本发明涉及通过基因工程微生物生产脂肪酸，特别涉及借助于例如植物酰基-ACP硫酯酶的加入和参与脂肪酸生物合成和/或降解途径的转录因子；这些转录因子与在脂肪酸合成途径、脂肪酸降解途径或中心代谢途径中挑选的基因的一种或更多种的组合的操纵生产大量的游离脂肪酸的工程微生物。

本发明将允许生产具有与最高理论产量接近的产量的游离脂肪酸。同样地，本发明将提供经济地生产共享脂肪酸合成途径或从脂肪酸合成途径分支的许多其它产物的必要框架。这些产物包括烃类、脂肪醇、羟基脂肪酸、二羧酸等。

更详细地，本发明为以下的一种或更多种：

一种用于生产脂肪酸的基因工程细菌，所述细菌包含含有以下的基因型：

i)过表达的酰基ACP硫酯酶(TE⁺)；