[发明专利]低抗凝血肝素

说明书

技术领域

本发明涉及具有低抗凝血活性的化学修饰的肝素及其制备方法。所述化学修饰的肝素有用于治疗其中肝素被视为是有效的，但是易产生副作用的疾病，如疟疾。

背景技术

肝素是天然产生的GAG(葡糖胺聚糖)，其在人和动物的所谓的肥大细胞中细胞内合成并储存。从猪肠粘膜工业制得的肝素是一种有效的抗凝血剂并且已经作为预防和治疗血栓栓塞性疾病的优选药物被用于临床超过60年。肝素治疗的主要潜在不良反应是由其抗凝血特性引起的出血性并发症。肝素是高度多分散的并且由分子量范围在5至40kDa，平均分子量约15至18kDa的异质多糖群体构成。

根据欧洲药典6.0的低分子重量/质量肝素(LMWH)被定义为“具有质均分子质量8以下的硫酸化GAG的盐，其中总质量的至少百分之六十具有8kDa以下的分子质量”。低分子质量肝素在多糖链的还原性或非还原性末端展现不同的化学结构。“根据干燥物质计算的效力为每毫克不在70IU以下的抗因子Xa活性”。抗因子Xa活性与抗因子IIa活性的比例为不在1.5以下”。临床上使用的LMWH具有3至15kDa范围的分子量，其平均值约为4至7kDa。由肝素的受控解聚/分级制得的LMWH展现更加有利的药理学和药代动力学特性，包括皮下注射后更低的诱导出血的倾向、增加的生物利用度和延长的半衰期。

肝素主要通过高亲和性地结合于并活化丝氨酸蛋白酶抑制剂，抗凝血酶(AT)，来发挥其抗凝血活性。通过特异性戊多糖序列调节该结合。AT，一种重要的生理学血液凝固抑制剂，通过与活化的凝血因子形成稳定的复合物来中和这些因子。肝素的结合引起AT的构象变化，其急剧地增加抑制凝血因子的比率，由此衰减血液凝固和血栓的形成。

由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的感染经常导致人类中严重的疟疾。被寄生的红细胞(pE)具有结合(体内：隐蔽(sequestrate))于深微脉管系统以及未感染红细胞的能力，所谓的玫瑰结(rosetting)。当结合过度时pE的隐蔽和玫瑰结增加严重疾病的产生，阻断血液流动，降低氧运输，并引起组织损伤。

肝素已经被建议作为严重疟疾期间发生的病理学治疗的有用的试剂。由于疟疾患者中所暗示的弥散性血管内凝血(DIC)的存在，肝素以前被用于治疗严重疟疾，但是由于严重副作用的发生例如颅内出血，其被停止了。另外，已经发现pE聚集不是主要归因于血液凝固，而是由于pE表面上寄生虫诱导的蛋白质与红细胞和血管内皮细胞上硫酸乙酰肝素(一种肝素相关的GAG)之间的非共价相互作用。肝素的作用被归因于其对该相互作用的竞争能力(Vogt等人，PloS Pathog.2006；2,e100)。因此，对于肝素衍生物具有医药上的需要，根据其适当大小和带电荷的链的分布设计的所述肝素衍生物具有显著降低抗凝血活性和诱导出血潜能。美国专利US5,472,953(Ekre等人)公开了具有降低的抗凝血活性的肝素在治疗疟疾中的用途。

AM Leitgeib等人，在Am.J.Trop.Med.Hyg.2011,vol.84(3),pp.380-396中报道了低抗凝血肝素的具有前景的研究，其被发现破坏从疟疾患者新鲜临床分离株的玫瑰结。

总之，基本地具有肝素的多阴离子特征，但是没有抗凝血作用的肝素衍生物将成为治疗其中肝素的抗凝血作用被视为是严重副作用的疾病的绝佳候选物。

发明内容

本发明涉及化学修饰的肝素，其被选择性地制备以保持多糖链的治疗作用，同时具有低的抗凝血作用。

在本发明的上下文中，肝素的坑凝血活性涉及AT增强抑制凝血因子Xa和IIa(凝血酶)的临床功能。其它术语将在以下说明书的相关文本中限定。

在一个方面，本发明涉及化学修饰的肝素的制备方法，所述化学修饰的肝素具有10IU/mg以下的抗因子II活性，10IU/mg以下的抗因子Xa活性，和约6.5至约9.5kDa的平均分子量(重均，Mw)。所述方法通常包含通过使肝素经受能够氧化非硫酸化的糖类残基的氧化剂而选择性氧化存在于水性溶液中的肝素和然后还原所得到的氧化糖类残基的步骤。所述方法通常还包含通过酸性约3至约4pH的水解作用解聚氧化的和还原的肝素链。可以一般顺序进行该方法，以刚表述的方式连续地氧化、还原和水解作用解聚，然而，还可以任何合适的顺序增加其它补充步骤。