[发明专利]用于定向核酸扩增和测序的组合物和方法

权利要求书

1.一种用于构建定向cDNA文库的方法，其包括：

a.逆转录RNA样品以产生第一链cDNA；

b.由所述第一链cDNA产生第二链cDNA，其中四种dNTP中的至少一种即dATP、dCTP、dGTP或dTTP在第二链合成过程中被修饰的dNTP替代并掺入所述第二链中，从而产生双链cDNA；

c.对所述双链cDNA进行末端修复；

d.将衔接子连接至所述双链cDNA，其中所述衔接子中仅有一种具有掺入所述衔接子的连接链中的修饰的dNTP；

e.进行缺口修复；和

f.用合适的裂解剂选择性裂解所述第二链和所述具有修饰的dNTP的衔接子，从而产生包含所述第一链cDNA的定向cDNA文库。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述修饰的dNTP包含dUTP。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法任选地进一步包括在步骤(c)之前断裂所述双链cDNA。

4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(f)包括裂解所述修饰的核苷酸的碱基部分，从而形成脱碱基位点。

5.如权利要求4所述的方法，进一步包括在所述脱碱基位点处裂解磷酸二酯骨架。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述裂解所述修饰的核苷酸的碱基部分包括酶的使用。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述在脱碱基位点处裂解磷酸二酯骨架包括酶、化学剂和/或热的使用。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述酶是内切核酸酶。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述内切核酸酶是脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶(APE)。

10.如权利要求6所述的方法，其中所述酶包含糖基化酶。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述糖基化酶为尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)或尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。

12.如权利要求7所述的方法，其中所述化学剂包含伯胺。

13.如权利要求7所述的方法，其中所述化学剂包含多胺。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述多胺包含N,N-二甲基乙二胺(DMED)。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述裂解剂包含糖基化酶和多胺。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述裂解剂包含糖基化酶和APE。

17.如权利要求1所述的方法，进一步包括扩增所述定向cDNA文库，从而产生扩增的产物。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述定向cDNA文库的扩增包括聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、单引物等温扩增(SPIA)或连接酶链式反应(LCR)。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述扩增包括PCR。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述扩增包括SPIA。

21.如权利要求17所述的方法，进一步包括对扩增产物进行测序的附加步骤。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述测序包括新一代测序。

23.如权利要求1所述的方法，进一步包括在逆转录后裂解所述RNA样品。

24.如权利要求23所述的方法，其中裂解所述RNA样品包括在逆转录后使所述RNA样品暴露于RNase。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述RNase为RNase H。

26.如权利要求23所述的方法，其中裂解所述RNA样品包括使所述RNA样品暴露于热或化学处理或其组合。

27.如权利要求1所述的方法，进一步包括从所述定向cDNA文库中减少或耗尽非期望的核酸序列。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述非期望的核酸为核糖体RNA(rRNA)。