[发明专利]呼吸道感染测定

说明书

本发明涉及核酸产品和相应地用于筛查生物样品存在引起呼吸道感染的微生物的方法。

呼吸道感染是全世界上最常见的人类疾病的起因(参见Murray和Lopez(1997)-Lancet，349，第1269-1276页)。缺乏抵抗力的个体(心脏、肺、免疫系统)、老年人和婴儿尤其有发展严重的并发症的危险。历史上，已经通过一组多路(multiplexed)实时(RT)PCR Taqman测定进行呼吸道感染的快速实验室诊断。然而，与该多路方法相关的一个显著的问题是需要制备、运行并且监测平行的筛查测定。由于进行的每个测定相对于单次测定引起消耗成本的加倍并且关于用于进行这些测定的昂贵的设备的磨损产生另外的操作负担，所以这表示不合需要的经济负担。所述多路方法还产生与多重测定的性能相关的另外的时间和人力负担。

因此，需要更有效的筛查系统。

本发明通过提供一种用于检测单一分离样品中存在或不存在多种引起呼吸道感染的微生物的简单的一步测定(即，单路形式)而解决上述问题中的一种或多种。

更详细地，本发明提供一种用于检测样品中存在至少六种引起呼吸道感染的微生物中的一种或多种或检测所述样品中不存在所述微生物的方法，所述方法包括：

A)将样品应用到测试卡上，其中所述测试卡包括六个分离的孔：

1)包含第一探针的第一孔，其中所述第一探针具有包含与核酸序列GGCAATGCWG(SEQ ID NO：1)具有至少80％的序列同一性的核酸序列的核酸序列；

2)包含第二探针的第二孔，其中所述第二探针具有包含与核酸序列GAYGGGACCR(SEQ ID NO：2)具有至少80％的序列同一性的核酸序列的核酸序列；

3)包含第三探针的第三孔，其中所述第三探针具有包含与核酸序列CACCAGACAC(SEQ ID NO：3)具有至少80％的序列同一性的核酸序列的核酸序列；

4)包含第四探针的第四孔，其中所述第四探针具有包含与核酸序列GGTCATTGGR(SEQ ID NO：4)具有至少80％的序列同一性的核酸序列的核酸序列；

5)包含第五探针的第五孔，其中所述第五探针具有包含与核酸序列CACTGGGCAC(SEQ ID NO：5)具有至少80％的序列同一性的核酸序列的核酸序列；

6)包含第六探针的第六孔，其中所述第六探针具有包含与核酸序列RGTGTTCATT(SEQ ID NO：6)具有至少80％的序列同一性的核酸序列的核酸序列；

B)允许所述样品中存在的核酸与所述孔中的探针接触；

C)检测其中样品核酸已经结合所述探针中的一种或多种的结合核酸复合物的存在；

D)其中结合核酸复合物的存在证实在所述样品中存在来自所述六种引起呼吸道感染的微生物中的一种或多种的核酸，并且其中不存在结合核酸复合物证实在所述样品中不存在来自所有所述六种引起呼吸道感染的微生物的核酸。

本申请人已经阐明的一个重要的现有技术问题是提供在单一组测定条件下(即，单路形式)相互相容(即，保留准确的结合特异性)的一组强健的探针。与本发明的方法相关的一个特别的优点是速度。例如，本发明的方法典型地在2.5小时内完成，优选在2或1.5小时内完成。相反，现有的多路测定典型地花费至少4-5小时，典型地至少5小时。

与本发明的单路(uniplex)(也称为单一通路(singleplex))测定方法相关的另一个优点是增加的灵敏性，其除了简单确定样品中存在或不存在特定病原体之外，还允许定量检测样品中的微生物(例如，病毒和/或细菌负荷)。

样品中的微生物(例如，病毒和细菌)可以进行针对每种微生物靶标的负荷校准。这允许定量样品中每种微生物的具体负荷。有利地，本发明的这种特质允许确定其中存在多种微生物的样品中的主要的微生物。例如，本发明的单路测定方法允许人们确定其中存在多种病毒的样品中的主要病毒。另外，本发明的方法允许随时间定量检测样品中的病毒，当存在特定病毒的病毒负荷的波动时，这是特别有用的。

此外，现有系统应用在膜上进行的杂交，而本发明的测定方法在封闭的(例如，无菌的)系统中进行，由此减少污染的可能性，这提供了另一种优点。

探针1-6分别允许灵敏检测下述：

1)呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV A和B)；

2)鼻病毒(Rhinoviruses)；

3)人变性肺病毒(Human Metapneumovirus，hMPV)；

4)流感病毒B(Flu B Quad)；