[发明专利]细胞内传递

说明书

相关申请

本申请要求2011年10月17日递交的美国临时申请第61/548,013号的优先权和2012年8月17日递交的美国临时申请第61/684,301号的优先权，其每一篇的内容通过引证在此并入本文。

联邦赞助研究声明

根据美国国立卫生研究院授权的Grant5RCl EB011187-02，本发明至少部分的被政府支持。政府享有本发明的特定权利。

背景技术

许多制药公司主要致力于研发小分子药物。

之所以被称为小分子药物是由于这些药物相对小的分子尺寸，这使其能够在体内自由扩散达到其靶点。这些分子还可以滑过其他作为极大阻碍的不可渗透的细胞膜。然而新一代的基于蛋白、DNA或者RNA的治疗剂不能容易的穿过细胞膜，因此需要进行细胞修饰来加速传递。

已经建立起来的方法使用化学或者电脉冲破坏细胞膜并将材料传递进入细胞质。合适的细胞内是研究、发开和实施下一代治疗剂中至关重要的步骤。

现有的方法常常难以开发并很难对其特定的应用产生高度专一性。因此，现有技术无法合适的解决许多临床上重要的细胞型(例如干细胞和免疫细胞)所具有的问题。因此，对更稳定并更精确地技术存在需要，以期解决现代生物/医学研究的需要。

发明内容

本发明基于一种出乎意料的发现，即，受控制的损伤，例如，使细胞经历收缩、快速拉伸、快速压缩、或者高剪切速率的脉冲，会导致细胞将分子从周围的培养基中吸收入细胞质。因此，本发明的特征在于一种含载体的微流体平台，用于直接将材料传递到真核细胞细胞质，所述材料例如化合物或者组合物。该装置可有效作为一种灵活的并且广泛应用的实验室工具，用于将理想的分子传递靶细胞。使用这里所描述的方法将分子传递入细胞是成比例的，例如，与细胞通过收缩和/或压力的速度呈线性比例的或者单调比例的。例如，在几秒内将50微升的细胞悬浮液通过该装置。通量范围在1个细胞/每秒每通道(或更少)至超过1000个细胞/每秒每通道之间。尽管细胞速度可以高达10m/s(或更高)，但一般通过收缩的细胞速度包括10mm/秒到500mm/秒。其他的通道可以平行放置从而增加系统的总通量。

分子的吸收是基于扩散的，而不是基于胞吞作用，即，通过本装置的途径之后，有效载荷(被传递到细胞中的化合物)存在于细胞质中而不在于核内质中。在细胞被处理之后，只有很少的或者没有所述有效载荷存在于核内质中。例如，大分子比小分子吸收的慢。受控制的细胞拉伸和细胞在收缩过程中的运动速度导致靶分子优先传递，同时保持细胞的存活能力和完整性。在处理之后，细胞存活率在70-100％，例如，通常在处理之后存活率为90％。与此相比，之前的只使用高剪切速率传递几秒钟或者几毫秒的方法会使细胞在处理之后具有很差的存活能力。与之前的技术相比，本发明的方法当细胞经历收缩时，使细胞在非常短的时间内(大约100微秒)经受范围在100-1000帕的剪切脉冲。但是本发明的技术与之前的技术是完全不同的。在本发明的技术中，优选细胞在经历收缩时发生完整的机械变形，与现有技术相比，这可以强化不同的剪切力。在优选的实施方案中，细胞不经历电流。在另一个实施方案中，使用结合的方式处理，例如，使用这里描述的装置实现机械变形，并在之后或者之前进行电穿孔(一种渗透转染，其中使用电流在细胞膜上产生临时的孔，从而允许核酸或者大分子进入)。

有效载荷是需要传递入细胞中的化合物或者组合物。例如，有效载荷可以包括蛋白质、荧光染料、量子点、碳纳米管、RNA分子、DNA分子、抗原或者其他大分子，纳米颗粒和物质的组合物。

分子向细胞的传递受到装置收缩幅度、收缩部分长度、进入区域的地理结构和装置通道宽度的影响。优选的，导管收缩部分的宽度是直径不超过4微米，导管收缩部分的长度优选在40-50微米。收缩部分的长度通常不会超过90微米。收缩部分的直径与被处理的细胞类型有关。如下所述，该直径小于细胞直径(例如，是细胞直径的20-99％)。许多细胞直径在5-15微米之间，例如，树突细胞直径是7-8微米。例如，当处理单个细胞时，收缩部分的直径是4.5、5、5.5、6或者6.5微米。在其他实施例中，处理人类卵子的收缩部分尺寸/直径在6.2微米和8.4微米范围内，虽然也可以使用更大或者更小的收缩部分(人类卵细胞的直径大约是12微米)。在另一个实施例中，使用直径在12微米到17微米之间的收缩部分处理胚胎(例如，2-3个细胞的簇)。