[发明专利]用于检测核小体加合物的方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于检测和测量核小体-蛋白质加合物的存在的方法以及此类测量用于疾病检测和诊断的用途。本发明还涉及鉴定核小体加合物生物标志用于疾病检测和诊断的方法和由所述方法鉴定的生物标志。

发明背景

人体包含几百种细胞类型。所有这些细胞类型均含有相同基因组，但广泛不同的表型和在体内不同的功能。该表型多样性是由于基因组在不同细胞类型中的差异表达。差异基因表达的控制并未完全了解，但基本机制包括由与基因相关的许多互联表观遗传信号(epigenetic signals)的基因调节，包括染色质包装为常染色质或异染色质的控制、核小体定位和核酸酶可接近位点的控制、DNA的甲基化和DNA在其周围缠绕的核小体结构中的变化。

核小体是染色质结构的基本单位并且由八个高度保守的核心组蛋白的蛋白质复合物组成（包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对）。在该复合物周围缠绕约146个碱基对的DNA。另一种组蛋白H1或H5充当接头，并且涉及染色质压实。DNA在通常被说成类似“串上的珠”的结构中绕在连续核小体周围，并且这构成开放的或常染色质的基本结构。在压实的或异染色质中，该串是卷曲的并且超卷曲成闭合和复杂的结构（Herranz和Esteller，2007）。

在成年人中的正常的细胞更新涉及每天通过约10¹¹细胞的细胞分裂的产生和主要通过细胞凋亡的相似数目的死亡。在细胞凋亡的过程期间，染色质分解成由细胞释放的单核小体和寡核小体。在正常条件下，这些被去除并且在健康个体中发现的循环核小体水平很低。升高水平在具有多种状况的个体中发现，所述状况包括多种癌症、自身免疫疾病、炎性状况、中风和心肌梗塞（Holdenrieder和Stieber，2009）。

单核小体和寡核小体可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测，并且几种方法已得到报道（Salgame等人，1997；Holdenrieder等人，2001；van Nieuwenhuijze等人，2003）。这些测定通常采用抗组蛋白抗体（例如抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3和H4）作为捕获抗体和抗DNA或抗H2A-H2B-DNA复合抗体作为检测抗体。然而，我们已发现这些测定的结果彼此不一致。此外，尽管血清或血浆中的大多数循环DNA据报道作为单核小体和寡核小体存在（Holdenrieder等人，2001），但测量的血清或血浆中的核小体和DNA水平并不良好吻合。循环细胞游离核小体(circulating cell free nucleosomes)水平的ELISA结果和如通过实时PCR（聚合酶链反应）测量的循环DNA水平之间的相关系数据报道在血清中是r=0.531，并且在血浆中是r=0.350（Holdenrieder等人，2005）。

核小体ELISA方法用于细胞培养中，主要作为检测细胞凋亡的方法（Salgame等人，1997；Holdenrieder等人，2001；van Nieuwenhuijze等人，2003），以及还用于测量血清和血浆中的循环细胞游离核小体（Holdenrieder等人，2001）。由濒死细胞释放到循环内的细胞游离血清和血浆核小体水平已通过ELISA方法在众多不同癌症的研究中进行测量，以评估其作为潜在生物标志的用途（Holdenrieder等人，2001）。平均循环核小体水平据报道在研究的大多数但并非全部癌症中很高。最高的循环核小体水平在肺癌个体中观察到。最低水平在前列腺癌中观察到，其在健康个体的正常范围内。然而，具有恶性肿瘤的个体据报道具有相当不同的血清核小体浓度，并且发现具有晚期肿瘤疾病的一些个体具有低循环核小体水平，在对于健康个体测量的范围内（Holdenrieder等人，2001）。由于这点和核小体水平升高的多种非癌症原因，循环核小体水平未在临床上用作癌症的生物标志（Holdenrieder和Stieber，2009）。