[发明专利]核酸扩增方法

权利要求书

1.一种核酸扩增方法，其特征在于，包含：

(a)将双链接头连接于包含靶DNA序列的双链DNA，调制由包含切口的双链DNA构成的环状双链DNA模板的工序，所述双链接头通过接头DNA链和与之互补的接头DNA链结合而形成双链，所述接头DNA链包含第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列，所述切口设置在所述双链接头上；和

(b)在链置换型DNA聚合酶的作用下，以该切口为起点，进行3’末端延伸反应，从而形成形状为该靶DNA序列和该能够形成折返结构的接头DNA链作为单链DNA串联连接多个的串联体的工序；

该串联体具有通过该折返结构进行了折叠的形状。

2.根据权利要求1所述的方法，所述双链接头具有接头DNA链，所述接头DNA链从5’末端向3’末端按照第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列的顺序构成、或者按照第1DNA序列、第3DNA序列及第2DNA序列的顺序构成、或者按照第2DNA序列、第1DNA序列及第3DNA序列的顺序构成。

3.根据权利要求1所述的方法，

所述双链接头包含第1接头DNA链和与该第1接头DNA链互补的第2接头DNA链，第1接头DNA链和第2接头DNA链结合而形成双链；

第1接头DNA链从5’末端向3’末端具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列；

第2接头DNA链从5’末端向3’末端具有与第3DNA序列互补的第3互补序列、与第2DNA序列互补的第2互补序列及与第1DNA序列互补的第1互补序列，该第1和第3互补序列为能够形成折返结构的序列；

所述方法包含：

(b1)在所述环状双链DNA模板中，于第1接头DNA链上的第1DNA序列的5’末端形成第1切口、于第2接头DNA链上的第3互补序列的5’末端形成第2切口的工序；

(b2)在链置换型DNA聚合酶的作用下，以第1切口为起点，3’末端延伸至第2接头DNA链上的第2切口位置，形成与第1接头DNA链具有相同序列的接头DNA链后停止延伸反应，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；

(b3)通过该接头DNA链的3’末端延伸反应，与靶DNA序列互补的DNA序列延伸，接着，生成与第2接头DNA链具有相同序列的接头DNA链，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；

(b4)通过该接头DNA链的3’末端延伸反应，与靶DNA序列相同的DNA序列延伸，接着，生成与第1接头DNA链具有相同序列的接头DNA链，然后该接头DNA链形成折返结构的工序；

(b5)重复工序(b3)和(b4)，从而形成形状为靶DNA序列、第1接头DNA链、与靶DNA序列互补的DNA序列及第2接头DNA串联连接多个的串联体的工序。

4.一种碱基序列确定方法，其特征在于，包含：

将通过权利要求1～3中任一项所述的方法形成的1个或者多个串联体固定于流路基板上的工序；

将引物结合于各个该串联体的接头DNA链中除能够形成折返结构的序列之外的序列上的工序；

将包含由多个碱基构成的识别位点且结合有与该识别位点的碱基种类相对应的标记的探针依次连接于该引物末端的工序；

基于所述标记，检测连接的探针，从而确定靶DNA序列的碱基序列的工序。

5.一种用于实施权利要求1～4中任一项所述的方法的试剂盒，其特征在于，包含双链接头，所述双链接头包含第1接头DNA链和与该第1接头DNA链互补的第2接头DNA链，第1接头DNA链和第2接头DNA链结合而形成双链；

其中，

第1接头DNA链具有第1DNA序列、第2DNA序列及第3DNA序列，该第1和第3DNA序列为能够形成折返结构的序列；

第2接头DNA链具有与第3DNA序列互补的第3互补序列、与第2DNA序列互补的第2互补序列及与第1DNA序列互补的第1互补序列，该第1和第3互补序列为能够形成折返结构的序列；

第1接头DNA链及第2接头DNA链中的一条链或者两条链上包含切口或者具有能够形成切口的序列。