[发明专利]用于酶促合成罗汉果苷化合物的方法和材料

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年11月23日提交的美国序列号61/563,303的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入。

技术领域

本发明涉及酶促合成罗汉果苷(mogroside)化合物的方法和材料，并且更具体地涉及使用尿苷-5'-二磷酸(Uridine-5'-diphospho，UDP)依赖的葡糖基转移酶(UGT)糖基化罗汉果醇(mogrol)以生产各种罗汉果苷化合物。

背景技术

罗汉果苷是从罗汉果(Siraitia grosvenorii(Swingle))，也称作罗汉果(Momordica grosvenori(Swingle))的果实分离的一类三萜糖苷。所述果实的提取物商业上用作天然的增甜剂。已经从罗汉果的果实鉴别出四种主要的化合物(罗汉果苷V、罗汉果苷IV、赛门苷I(Siamenoside I)和11-氧代罗汉果苷V)，其负责这些水果的甜味。参见图1。罗汉果苷V是这四种化合物中最丰富的，占干果实的大约0.57％(重量/重量)，随后是罗汉果苷IV和赛门苷I，各自含有四个葡萄糖部分(moiety)。11-氧代罗汉果苷V在C-11位具有酮基而不是羟基。参见例如Takemoto等，Yakugaku Zasshi，103，1151-1154；1155-1166；1167-1173，(1983)；Kasai等，Agric.Biol.Chem.53，3347-3349(1989)；Matsumoto，Chem.Pharm.Bull.38，2030-2032(1990)；和Prakash，等，J.Carbohydrate Chem.30，16-26(2011)。

所有的罗汉果苷共享相同的三萜核心，称罗汉果醇。用不同数目的葡萄糖部分糖基化糖苷配基罗汉果醇以形成各种罗汉果苷化合物。罗汉果苷被认为通过以下方式合成：从常见的三萜前体角鲨烯合成葫芦二烯醇(cucurbitadienol)；P450氧化葫芦二烯醇以产生糖苷配基罗汉果醇；以及使罗汉果醇糖基化以依次添加5个葡糖糖从而产生罗汉果苷V。参见Tang等，BMC Genomics，12，343(2011)。中间体葫芦二烯醇和罗汉果醇二者都存在于果实中，因为它们已经作为次要产物被分离。参见Ukiya等，J.Agric.Food Chem.50，6710-6715(2002)。糖苷中间体存在于11-羟基和11-氧代系列二者中，并且由于果实成熟逐渐从罗汉果苷I变成罗汉果苷V，这表明三萜核心在随后的糖基化之前被P450酶完全氧化。然而，仍未鉴别到负责产生罗汉果苷的酶。

发明内容

在一个方面，本文特载(feature)了生产罗汉果苷化合物的方法。所述方法包括将罗汉果醇与尿苷-5’-磷酸(UDP)依赖的葡糖基转移酶(UGT)孵育以生产罗汉果苷化合物(例如，罗汉果苷Ia、汉果苷Ib或在C25-OH糖基化的罗汉果苷化合物)。所述UGT可选自73C3、73C6、85C2、73C5和73E1。该UGT可重组生产或可处于重组体宿主的细胞裂解物中。

本文还特载了生产罗汉果苷化合物的方法。所述方法包括将罗汉果醇与从表达UGT的重组体宿主制备的细胞裂解物接触以生产罗汉果苷化合物(例如，罗汉果苷Ia、罗汉果苷Ib或在C25-OH糖基化的罗汉果苷化合物)。所述UGT可选自73C3、73C6、85C2、73C5和73E1。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属之领域的普通技术人员通常理解相同的含义。虽然以下描述了合适的方法和材料，但类似或等同于本文所述的那些方法和材料可用于实施本发明。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体并入。在存在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅用于举例说明的目的并且不旨在成为限制。本发明的其他特性和益处将从以下的详细描述而明显。根据专利法中的标准实践，申请人保留使用过渡性短语“包含”、“基本由......组成”或“由......组成”替代地保护任意公开发明的权利。

附图说明

图1含有罗汉果苷V、罗汉果苷IV、赛门苷I和11-氧代罗汉果苷V的化学结构。

图2是使用UGT从罗汉果醇生物合成罗汉果苷Ia和罗汉果苷Ib的描述。

图3含有以下UGT的氨基酸序列：UGT73C3、UGT73C5、UGT73C6、UGT73E1和UGT85C2(分别为SEQ ID NO：1-5)。