[发明专利]在存在甲酸的情况下产生含卟啉多肽

说明书

优先权

本专利申请要求2011年11月28日提交的美国临时专利申请No.61/564,232的优先权，该专利申请全文据此以引用的方式并入。

技术领域

本发明的组合物和方法涉及在深层培养液中产生多肽，具体地讲涉及通过微生物发酵大规模产生含卟啉多肽。

背景技术

微生物表达的多肽用于多种工业和家庭应用，包括纺织物处理、织物护理、乙醇制备、酿造和烘焙等等。多肽通常以稳定的干燥或液体制剂提供给最终用户，以保持其活性。

一些微生物表达的多肽包含卟啉，即由与金属原子例如铁、镁、铜、镍、钴、钼和钒配位的四个互相连接修饰的吡咯亚基构成的杂环大环。含卟啉多肽可用甲酸稳定，甲酸通常作为制剂成分加入到多肽中。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及在存在甲酸的情况下从深层培养液中培养的真菌细胞中产生含卟啉多肽。

在一个方面，提供了用于在宿主细胞中产生含卟啉多肽的方法，该方法包括：使产生含卟啉多肽的宿主细胞在合适的培养基中生长，以产生发酵液；向发酵液加入有效量的甲酸；以及回收所产生的含卟啉多肽；其中与在不存在甲酸的情况下使相同宿主细胞在等同培养基中生长相比，发酵液中存在甲酸增加了含卟啉多肽的活性、稳定性或表达水平。

在一些实施例中，在加入甲酸之前，使宿主细胞生长到补料分批阶段。在一些实施例中，在加入甲酸之前，宿主细胞的生长基本上完成。在一些实施例中，在加入甲酸之前，使宿主细胞生长到准备诱导产生含卟啉多肽的阶段。在一些实施例中，培养基包含葡萄糖，并且在加入甲酸之前，葡萄糖基本上已被宿主细胞耗尽。

在一些实施例中，发酵液中甲酸的浓度小于或等于约2.0克甲酸/千克发酵液。在一些实施例中，发酵期间加入的甲酸的累积量为约0.007至约1.35摩尔甲酸/千克(kg)发酵液。在一些实施例中，所加入的甲酸的量为约0.03至约7.1毫摩尔甲酸/小时经历的发酵时间/千克发酵液。在一些实施例中，所加入的甲酸的量为约40至约4400毫摩尔甲酸/小时经历的发酵时间/千克底物干燥固体。在一些实施例中，所加入的甲酸的量为约50至约7500摩尔甲酸/摩尔活性含卟啉多肽。

在一些实施例中，甲酸是甲酸的形式。在一些实施例中，甲酸是甲酸盐的形式。在一些实施例中，甲酸是甲酸钠的形式。

在一些实施例中，宿主细胞是真菌细胞。在一些实施例中，宿主细胞是丝状真菌细胞。在一些实施例中，宿主细胞是木霉属(Trichoderma)细胞。

在一些实施例中，含卟啉多肽是含血红素多肽。在一些实施例中，含卟啉多肽是过氧化氢酶。

在另一个方面，提供了通过任何所述方法产生的含卟啉多肽。在一些实施例中，含卟啉多肽是过氧化氢酶。

通过本发明的描述和附图，所述组合物和方法的这些方面和其他方面以及实施例将显而易见。

附图说明

图1是曲线图，示出在存在或不存在甲酸或甲酸钠的情况下生长的细胞培养物中细胞发酵液中存在的过氧化氢酶活性的量随时间而变化。

图2是曲线图，示出在存在或不存在甲酸或甲酸钠的情况下生长的细胞培养物中细胞发酵液中产生的总蛋白量随时间而变化。

图3是曲线图，示出在存在或不存在甲酸或甲酸钠的情况下生长的细胞培养物中细胞发酵液中存在的针对总蛋白生成量归一化的过氧化氢酶活性的量随时间而变化。

具体实施方式

本发明的组合物和方法涉及在存在甲酸或甲酸盐(本文统称为“甲酸”)的情况下在深层培养液中生长的真菌细胞中产生含卟啉多肽。甲酸是含卟啉多肽的已知稳定剂，其通常加入到从细胞与碎片分离后回收的多肽中。虽然一些细菌可在存在甲酸的情况下生长，但甲酸是熟知的杀真菌剂，通常不加入到真菌细胞的深层培养物中。

已经出乎意料地发现，在真菌发酵的补料分批阶段，大多数或所有细胞生长发生之后，可将甲酸加入到发酵液(即含细胞的培养基)中。发酵的补料分批阶段是指细胞已基本上消耗初始培养基中的一些营养物质(如，葡萄糖)，并且必须提供额外的营养物质以维持其代谢的时间。此时，通常诱导细胞生成所关注的蛋白质，例如通过补加诱导剂[如，2-O-β-吡喃葡萄糖基-D-葡萄糖(槐糖)、异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)等等]来诱导，具体取决于特定生物体和基因构造。此发酵阶段存在甲酸似乎不影响细胞活力，如蛋白质生成速率所证实的那样。然而，发酵期间存在甲酸确实增加了活性含卟啉多肽的产率，可能是在多肽生成时即将其稳定。这样，含卟啉多肽可在低成本和高滴定度下生成。