[发明专利]使用核酸探针和珠粒亚组检测呼吸道病原体的组合物和方法

权利要求书

1.一种对样品筛查多种呼吸道病原体以检测特定病原体的方法，其中所述样品是工业样品，或者是冰、岩石、热液喷口和空气；或者是来自卫生保健环境、工业环境或实验室环境的样品，

所述方法包括：

(a)从所述样品分离核酸，所述核酸推定包含来自一种或多种呼吸道病原体的核酸；

(b)对所述核酸进行固相扩增，其中所述扩增采用包含SEQ ID NO：1的正向引物和SEQID NO：17的对应反向引物的含水引物对，以及固定在珠粒盘中的珠粒上的SEQ ID NO：37所示的相应寡核苷酸探针；其中所述含水引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，并且其中所述含水引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入所得扩增子内的第一光学可检测标记；其中

通过与固定至珠粒盘中的珠粒上、与扩增子的区域互补的所述寡核苷酸探针杂交来捕获所述扩增子；

所述珠粒盘具有珠粒亚组，每一个亚组在珠粒尺寸和任选地第二光学可检测标记的强度上是均质的，从而基于尺寸和/或第二光学可检测标记的强度产生异质珠粒盘，并且其中亚组的数目对应于待筛查的呼吸道病原体的数目；

(c)基于所述第一光学可检测标记的强度确定扩增子已结合于哪个珠粒，并且当扩增子结合于多个亚组的珠粒时，基于珠粒尺寸和任选地基于第二光学可检测标记的强度区分所述多个亚组的珠粒；

其中扩增子对特定亚组的珠粒的结合指示样品中存在特定呼吸道病原体。

2.权利要求1的方法，其中扩增中还采用包含选自SEQ ID NO：2至16或33或35中的正向引物和选自SEQ ID NO：18至32或34或36中的对应反向引物的含水引物对，以及选自SEQ IDNO：38至54的相应寡核苷酸探针；或者扩增中还采用选自表8所列的SEQ ID NO：74至141所示序列中2个或更多个序列的引物对和对应探针；其中所述引物对指导来自呼吸道病原体的核酸的区域的扩增，引物对的数目基于期望被筛选的病原体数目来选择，并且其中所述引物对的至少一个成员包含在扩增后被掺入所得扩增子内的第一光学可检测标记。

3.权利要求1的方法，其中由包含第一光学可检测标记的引物的延伸起始的扩增子用作模板，用于包含第二光学可检测标记的寡核苷酸的杂交和延伸，其中将所述寡核苷酸固定于珠粒盘中的珠粒上。

4.权利要求2的方法，其中包括基于第二光学可检测标记的强度区分多个亚组的珠粒。

5.权利要求1的方法，其中所述第一和第二光学可检测标记是荧光团，所述荧光团选自羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白、PerCP、别藻蓝蛋白、烟酸己可碱33342、DAPl、SYTOX蓝、烟酸己可碱33258、色霉素A3、光辉霉素、YOYO-I、SYTOX绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-1、To-PRO-I、噻唑桔、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、Alexa Fluor染料、BoDipy染料、CY染料、6-FAM、PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT、六氯荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,T-二甲氧基荧光素、Oregon绿染料、罗丹明染料、TRITC₃四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、四氯荧光素(TET)、Red 6B₅FluorX、BODIPY-FL和德克萨斯红。

6.权利要求5的方法，其中所述Alexa Fluor染料选自Alexa Fluro-350、-430、-488、-532、-546、-555、-556、-594、-633、-647、-660、-680、-700和-750，所述BoDipy染料选自BoDipy 630/650和BoDipy 650/665，所述Cy染料选自Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5和Cy7，所述Oregon绿染料选自488-X和514，以及所述罗丹明染料选自X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX。

7.权利要求6的方法，其中所述第一光学可检测标记为AlexaFluor-647。