[发明专利]酵母中生产古细菌蛋白酶的方法

说明书

对序列表的引用

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技术领域

本发明涉及通过表达融合蛋白在酵母中微生物生产蛋白酶多肽。下面例举的生产为源自古细菌激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的蛋白酶。

背景技术

目前以多种方式工业化生产蛋白或多肽，所有这些均涉及生产蛋白的微生物的培养。优化工业蛋白产量的数种方法在本领域中是熟知的并且正被常规地利用，诸如操纵生长培养基、改造微生物例如通过影响期望蛋白的编码基因的表达的对遗传元件如启动子和信号序列等的突变、变异，以及操纵基因本身，以便例如增强蛋白稳定性或活性。

先前已描述了融合蛋白作为生产其他方式难以获得的蛋白的一种方式，一个实例可以是活性人抗体(Goshorn,S.C.等人,Cancer Research,1993,Vol.53(9)pp.2123-2127)或在芽孢杆菌属宿主中生产工业酶(WO00/75344)。

发明内容

来自极端微生物的酶常常具有工业应用感兴趣的性质，例如，非常高的热稳定性。然而，它们可能难以以工业相关的量并以活性形式生产。

本发明人发现，来源于古细菌激烈火球菌的蛋白酶难以在面包酵母(baker’s yeast)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达，即使是从设计用于在酵母中和分泌信号(该分泌信号通常在酵母中良好运作)一起表达的合成基因中表达时也是如此(参见实施例1)。

然而，令人惊奇地发现，当古细菌蛋白酶与三个不同的异源真菌分泌的载体蛋白之中任一者翻译融合而表达时，蛋白酶可以以其成熟和活性形式由酿酒酵母生产和分泌(参见实施例2)。

因此，在第一方面，本发明涉及在酵母中生产蛋白酶的方法，包括：

(a)提供包括至少一个多核苷酸表达构建体的酵母宿主细胞，该多核苷酸表达构建体编码与第二多肽翻译融合的由该宿主细胞分泌的第一多肽，其中该第二多肽选自：

(i)其成熟部分与SEQ ID NO:2的成熟多肽；优选与SEQ ID NO:2的位置[1-412](包含两端)具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％氨基酸序列同一性的蛋白酶；

(ii)其成熟部分由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；优选与SEQ ID NO:1的位置[397-1632](包含两端)具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％DNA序列同一性的多核苷酸所编码的蛋白酶；

(iii)其成熟部分由在低等严格条件、中等严格条件、中高等严格条件、高等严格条件或极高等严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；优选与SEQ ID NO:1的位置[397-1632](包含两端)；或两者中任一者的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的蛋白酶；

(iv)SEQ ID NO:2的成熟多肽、优选SEQ ID NO:2的位置[1-412](包含两端)的变体，其包括在一个或多个位置上的取代、缺失和/或插入；和

(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)多肽的具有蛋白酶活性的片段，

(b)在有益于该第一多肽的表达和分泌的条件下培养宿主细胞，由此分泌翻译融合多肽并生产成熟蛋白酶；和

(c)任选地，回收蛋白酶。

在第二方面，本发明涉及如第一方面的步骤(a)中所限定的酵母宿主细胞。

在最后一个方面，本发明涉及如第一方面的步骤(a)中所限定的多核苷酸表达构建体。

具体实施方式

定义