[发明专利]用于制备糖‑蛋白质糖缀合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及缀合的糖领域，特别是来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域，以及用于形成复合糖的载体。可将复合糖用于免疫接种。

发明背景

已经将来自细菌的糖用于疫苗多年。然后，由于糖是非T细胞依赖性抗原，所以它们免疫原性差。与载体缀合可以将非T细胞依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，从而增强记忆应答，并允许产生保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗是基于复合糖的，并且原型结合疫苗(prototype conjugatevaccine)是针对流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)b型(‘Hib’)的[例如参见参考文献64的第14章]。

革兰氏阴性菌由含脂多糖的外膜围绕。脂多糖是作为内毒素并在哺乳动物中诱发强免疫应答的一组分子。每一脂多糖包含三个部分：O-抗原(也称为O-特异多糖或O-多糖)、核心结构域和脂质A结构域。针对来自特定革兰氏阴性菌的O-抗原的抗体可以赋予针对该细菌感染的保护。因此，已经设想了含有与载体蛋白缀合的O-抗原的疫苗。例如，基于O-抗原的结合疫苗已经建议用于多种沙门氏菌(Salmonellae)(例如，参考文献1和2中的肠沙门氏菌(Salmonella enterica)中的血清型鼠伤寒杆菌(Salmonella Typhimurium)和甲型副伤寒沙门氏菌(SalmonellaParatyphi A))；志贺氏杆菌属(Shigella)[参考文献3、4、5、6、7、8和9]；以及大肠杆菌(Escherichia coli)[参考文献10和11]。在这些疫苗中，O-抗原与来自全长脂多糖的核心结构域连接(即缀合的多糖是没有其脂质A结构域的脂多糖)。多糖通过其核心结构域与载体缀合。该核心结构域自身可以诱导保护性抗体，因此设想结合疫苗含有不与O-抗原连接的核心结构域[参考文献12]。

已知将含核心结构域的多糖与载体蛋白缀合的多种方法。一些方法涉及通过连接体缀合之前，多糖链的随机活化(例如使用溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨吡啶四氟硼酸酯(CDAP))(参见例如，参考文献1和2)。其他方法是更有选择性的，涉及该链的特异性残基(例如核心结构域的2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)端)。例如，参考文献13的方法涉及KDO端中的羰基与己二酸二酰肼(ADH)连接体之间的还原胺化。涉及还原胺化的反应通常非常慢，例如参考文献13中需要7天的步骤。另一选择性方法描述于参考文献9中，这次涉及通过KDO中的羧基，使用1-乙基-3–(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDAC)和ADH的偶联。在这些非选择性和选择性方法中，通常使用EDAC进行与载体的后续反应，EDAC活化蛋白质中的用于与连接体反应的羧基。该EDAC活化可以引起KDO亚基中羧基的活化，导致不想要的副反应。EDAC活化还可以引起载体蛋白的交联，因为蛋白质中活化的羧基可以与蛋白质中的而非连接体中的伯胺基反应。

因此，仍存在制备缀合物，特别是来自革兰氏阴性菌的脂多糖的核心结构域的其他以及更好的方法的需求。

发明公开

本发明基于缀合方法，其可以用于取代现有技术的缀合方法。这些方法可以比现有技术方法，特别是涉及还原胺化的那些方法更快地施行。该方法还不需要使用EDAC，这避免了不想要的副反应。在研发这些方法期间，发明人发现了不需要使用毒性化合物来纯化中间化合物的方法。因此，本方法可以更安全地实施。与现有技术的缀合物相比，得到的缀合物具有不同的，优选地改进的免疫学特性。

因此，本发明提供了用于将多糖与载体蛋白缀合的备选或改进方法，以及通过这些方法获得或者可获得的缀合物。本发明还提供了用于本发明方法的中间化合物，以及用于制备这些中间化合物的方法。

本发明的第一方面

在第一个方面，本发明提供了用于制备多糖和载体分子的缀合物的方法，其包括以下步骤：(a)使多糖与连接体偶联，以形成多糖-连接体中间产物，其中连接体的游离端是酯基；和(b)使酯基与载体分子中的伯胺基反应，以形成多糖-连接体-载体分子缀合物，其中连接体通过酰胺键与载体分子偶联。不同于参考文献1、2和13中所使用的缀合方法，本发明不需要使用EDAC活化载体分子，从而避免了不想要的副反应。本发明还提供了该方法的各个步骤(a)和(b)；通过该方法获得的或者可获得的缀合物；以及通过该方法的步骤(a)获得的或者可获得的多糖-连接体中间产物。

本发明第一方面的步骤(a)