[发明专利]蛋白质表达

权利要求书

1.用于生成感兴趣的重组蛋白质或多肽的方法，包括以下步骤：

-提供经遗传修饰的酵母细胞，其包含：

a)分泌盒，其包含编码感兴趣蛋白质或多肽的重组核酸分子，和

b)至少一个重组启动子可操作地连接于编码多肽或蛋白质的至少一个基因，所述多肽或蛋白质支持所述细胞内多肽或蛋白质的生物合成，所述至少一个基因位于未经遗传修饰的野生型酵母细胞的天然基因组基因座，其中所述编码生物合成支持性多肽或蛋白质的至少一个基因的天然存在的启动子通过在所述天然存在的启动子内的至少一个突变而失活，

-在允许所述感兴趣的蛋白质或多肽和所述编码生物合成支持性多肽或蛋白质的至少一个基因表达的条件下，在培养基中培养所述经遗传修饰的酵母细胞，并

-从所述培养基分离所述感兴趣的蛋白质或多肽。

2.依照权利要求1的方法，特征在于所述至少一个重组启动子使得所述经遗传修饰的酵母细胞相比于所述未经遗传修饰的野生型酵母细胞能够多产生至少100％，优选至少200％，更优选至少300％的支持多肽或蛋白质生物合成的所述多肽或蛋白质。

3.依照权利要求1或2的方法，特征在于编码支持所述细胞内多肽或蛋白质的生物合成的多肽或蛋白质的所述至少一个基因是分子伴侣(chaperone)。

4.依照权利要求3的方法，特征在于所述分子伴侣选自下组：蛋白质二硫化物异构酶、结合蛋白Kar2/BiP和钙联接蛋白。

5.依照权利要求1至4中任一项的方法，特征在于所述重组启动子是可诱导的经遗传修饰或未经修饰的酵母启动子。

6.依照权利要求5的方法，特征在于所述酵母启动子选自下组：AOX1启动子、GAL1启动子、PGK启动子、ADH启动子、FDH启动子和FLD启动子。

7.依照权利要求6的方法，特征在于所述酵母启动子是AOX1启动子，其包含SEQ ID No.1的核苷酸170至235或694至723或694至723和737至738内的至少一个突变。

8.依照权利要求1至7中任一项的方法，特征在于所述酵母细胞是甲基营养型酵母细胞，优选选自由毕赤酵母(Pichia)属的酵母组成的组，优选为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。

9.依照权利要求1至8中任一项的方法，特征在于所述编码生物合成支持性多肽或蛋白质的至少一个基因的所述天然存在的启动子的至少一个突变是缺失。

10.依照权利要求9的方法，特征在于所述编码生物合成支持性多肽或蛋白质的至少一个基因的所述天然存在的启动子的至少50个核苷酸，优选至少100个核苷酸，更优选至少200个核苷酸，甚至更优选至少500个核苷酸是缺失的。

11.一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：

-至少一个重组启动子可操作地连接于编码多肽或蛋白质的至少一个基因，所述多肽或蛋白质支持所述细胞内多肽或蛋白质的生物合成，所述至少一个基因位于未经遗传修饰的野生型酵母细胞的天然基因组基因座，其中所述编码生物合成支持性多肽或蛋白质的至少一个基因的天然存在的启动子通过在所述天然存在的启动子内的至少一个突变而失活，和

-分泌盒，其包含编码感兴趣蛋白质或多肽的重组核酸分子。

12.依照权利要求11的细胞，特征在于所述至少一个重组启动子使得所述经遗传修饰的酵母细胞相比于所述未经遗传修饰的野生型酵母细胞能够多产生至少100％，优选至少200％，更优选至少300％的支持多肽或蛋白质生物合成的所述多肽或蛋白质。

13.依照权利要求11或12的细胞，特征在于编码支持所述细胞内多肽或蛋白质的生物合成的所述多肽或蛋白质的所述至少一个基因是分子伴侣。

14.依照权利要求13的细胞，特征在于所述分子伴侣选自下组：蛋白质二硫化物异构酶、结合蛋白Kar2/BiP和钙联接蛋白。

15.依照权利要求11至14中任一项的细胞，特征在于所述重组启动子是可诱导的经遗传修饰或未经修饰的酵母启动子。