[发明专利]制备生物材料的方法

说明书

发明介绍和背景

本发明涉及，制备获自生物样品(更具体地血液或痰样品)的生物材料的方法。

制备获自血液或痰样品的生物材料的方法已为公众所知数十年。这些方法基于制备和纯化生物材料的多个步骤。例如，通常地，已知的制备和纯化核酸的方法包括如下步骤：

-通过离心从平衡的血液样品中分离白细胞级分；

-用去污剂裂解白细胞级分；

-用蛋白酶消化白细胞级分；

-用有机溶剂例如苯酚从消化的白细胞级分中提取生物材料；和

-通过添加乙醇来沉淀生物材料。

随后对沉淀的生物材料进行分析，或将其储存或运输以用于后续分析。

因此，这些方法的第一个缺点是，由于上述的多个步骤，这些方法是耗时又耗力的。使用该方法的另一个缺点是，以去污剂和溶剂的形式添加的酶和试剂干扰了生物材料的分析。这些方法的另一个缺点是，由于上述步骤的相对复杂性和所使用的试剂的性质，这些方法的实施大部分局限于实验室内，且不适合于在收集血液样品的场所运用。

已知的从血液样品制备生物材料的方法的另一个缺点是，它们需要常规的样品手工处理，从而增加了实验室人员被存在于血液样品中的肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和其他病原体感染的风险。而且已发现，这些已知的方法会增加样品交叉污染的风险，从而有可能导致假阳性结果。这在将人错误诊断为患有HIV时会造成破坏性结果。

Boom等人(1989)和Bush等人(1991)都公开了，通过使用强离液剂硫氰酸胍(GuSCN)裂解人细胞，随后将DNA吸着至玻璃粉来制备生物材料例如DNA的方法。这些方法利用，基于玻璃的吸着剂在高盐浓度下结合DNA或核酸，而在低盐浓度下释放DNA或核酸的能力。

Boom等人(1989)和Bush等人(1991)提出的方法的缺点是，其由多个步骤组成，包括裂解、结合和几个洗涤步骤(使用不同缓冲液)，并因此不适合用于从血液样品中快速或立即制备用于分析的生物材料。特别地，由于血液中存在大量蛋白，该方法不适于从全血样品中制备核酸材料。此外，在不包含几个洗涤步骤的情况下，核酸会被红细胞污染，从而抑制PCR扩增。

此外，从生物样品例如血液和组织中捕获生物材料的多种方法已被开发出来并且是可商购获得的。例如US5,346,994公开了从生物组织分离大体上纯化的RNA、DNA和蛋白的方法，其包括如下步骤：

(a)为了从生物组织中提取大体上纯化和未降解的RNA、大体上纯化和未降解的DNA和蛋白质，将组织样品在包含有效量的苯酚、胍盐化合物和选自硫氰酸铵和硫氰酸钠的硫氰酸盐化合物的溶剂溶液中匀浆，以形成匀浆物；

(b)添加不溶于水的有机溶剂至所述匀浆物中并使之沉降，以形成由包含大体上纯化、未降解的RNA的水相，包含蛋白的有机相和包含大体上纯化、未降解的DNA的中间相组成的混合物；

(c)通过添加低级醇从水相中沉淀RNA，并通过沉降作用回收沉淀的RNA；

(d)用水提取有机相和中间相；

(e)通过添加低级醇从有机相中沉淀蛋白，并通过沉降作用回收沉淀的蛋白；和

(f)通过添加CsCl、柠檬酸钠溶液和低级醇从中间相中沉淀DNA，并通过沉降作用回收沉淀的DNA。

从上文可以清楚地看出，上述专利公开的方法不仅耗时和相对复杂，而且限于特定酶和试剂的使用。

因此，存在对从血液样品中制备无污染的生物材料、而无需应用必须在实验室环境中进行的多个连续步骤的有效和稳健的方法的长期需求。

美国专利申请US2010/0291536A1(“'563申请”)公开了，通过以下步骤来收集、处理和分析生物材料的方法和装置：将来源材料引入样品容器，将来源材料转移至加工装置，以及热学地、化学地和/或机械地处理所述来源材料，以改变所述来源材料的至少一个组成性特征和从所述来源材料中释放或产生目标材料。此外，该申请说明书第3页第23段陈述，所述来源材料特别地可包括血液和痰。然而，如其发明人所证实的，使用'563申请中公开的方法的缺点是，他们不能成功地将该申请说明书中公开的方法应用于血液样品。

'563申请中公开的发明的另一个缺点是，其需要发生在两个分离的腔室或孔中的两个不同的步骤。因此，本发明的发明人开展了研究，其目的在于改进'563申请中公开的方法，以便其能够通过使用同时发生在单个腔室中的步骤而成功应用于血液样品。

发明目的